陳切希， 簡志青， 賈冬英， 遲原龍， 姚　開

(1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都 610065； 2.元智大學(xué)生物工程與科技研究所，臺灣桃園 32003)

近年來，隨著人類對農(nóng)產(chǎn)品的需求量不斷增大，農(nóng)藥的使用量也呈不斷上升趨勢，然而長期使用造成了農(nóng)畜產(chǎn)品和土壤中農(nóng)藥的殘留量超標。β-氯氰菊酯是一種重要的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，廣泛施用可能導(dǎo)致環(huán)境中殘留量超標，直接或間接對人類健康造成威脅[1-2]。微生物降解法具有安全、環(huán)保、無二次污染等特點被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品以及土壤中農(nóng)藥的降解。目前，具有轉(zhuǎn)化效率高的微生物已被應(yīng)用于環(huán)境或農(nóng)作物土壤中殘留農(nóng)藥的降解[3]，然而多數(shù)菌株只能將β-氯氰菊酯(β-CY)降解為3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)[4]。原生質(zhì)體融合技術(shù)是工業(yè)上微生物育種的一種重要手段，可以在種間、屬間以及跨界融合[5]。原生質(zhì)體制備和再生是其融合過程非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，直接決定育種的效率[6]。筆者所在實驗室前期從污染土壤中分離到地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌SC-1，前者可以將β-CY降解為3-PBA，后者可以將 3-PBA 繼續(xù)降解[7]。吳雙研究表明，制備的菌株B-1和菌株SC-1可濕性粉劑可以修復(fù)β-CY污染的土壤，有效降低小白菜中β-CY殘留[8]。本研究探討了地衣芽孢桿菌 B-1 和鞘氨醇單胞菌SC-1的原生質(zhì)體制備和再生條件，以期為通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育β-CY和3-PBA高效降解菌奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1)為實驗室前期從茶園土壤分離馴化并保存的菌種，適宜條件下對β-CY 降解率為94.12%。鞘氨醇單胞菌SC-1(Sphingomonassp. SC-1)為筆者所在實驗室前期從農(nóng)藥廠排污渠下游土壤中分離并保存的菌種，可以礦化降解 3-PBA。

β-CY原藥(含量96.8%，榮城化工公司)，3-PBA標準品(純度>98%，梯希愛化成工業(yè)有限公司)，溶菌酶(100 000 U/mg，Sigma公司)，酸水解酪蛋白、胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂(BD公司)，蔗糖、葡萄糖、順丁烯二酸、琥珀酸鈉、甘露醇、青霉素、甘氨酸、BSA(Sigma公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0，吐溫80 2.0 mL，121 ℃滅菌 20 min；LB瓊脂培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入瓊脂18 g和定量β-CY 或3-PBA工作液，使其濃度為100 mg/L，121 ℃滅菌20 min；再生培養(yǎng)基DM3：參照文獻[9]制備，用于菌株B-1原生質(zhì)體的再生；再生培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10 g，蔗糖171 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0，吐溫80 2.0 mL，121 ℃滅菌20 min，用于菌株SC-1原生質(zhì)體再生；原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)：0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH值6.5，121 ℃滅菌20 min；Tris-HCl緩沖液：Tris-HCl 0.01 mol/L，pH值8.0，121 ℃滅菌 20 min；EDTA溶液：EDTA 0.1 mol/L，用KOH溶液調(diào)pH值至 8.0，121 ℃滅菌20 min；溶菌酶液：用SMM溶液分別配制溶菌酶濃度為2.0 mg/mL和10 mg/mL溶液，0.22 μm膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SP-830 PLUS可見光分光光度計(Metertech公司)，UB-10 精密酸度計(Denver公司)，Axiostar Plus光學(xué)顯微鏡(Zeiss公司)，CF16RXII高速冷凍離心機(Hitachi公司)。

1.2　試驗方法

1.2.1菌株B-1和菌株SC-1生長曲線繪制將菌株 B-1 和菌株SC-1分別劃線接種于β-CY或3-PBA濃度為100 mg/L的LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，無菌生理鹽水洗下菌苔，混勻，按5.0%體積比例接入β-CY或 3-PBA 濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測其吸光度D600 nm，以培養(yǎng)時間對D600 nm作圖。

1.2.2菌株B-1原生質(zhì)體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株B-1接入β-CY濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。SMM洗滌菌體2次，離心(4 ℃，8 000 r/min)10 min，SMM重懸并調(diào)其D600 nm為1.2，取少量適當稀釋后涂布于LB平板，30 ℃培養(yǎng) 24～48 h，菌落數(shù)記為A；余下的菌懸液中加入不同濃度的溶菌酶液，37 ℃振蕩(100 r/min)30 min，離心(4 ℃，4 000 r/min)10 min，沉淀重懸于SMM，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基DM3，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌落數(shù)分別記為B(未被除壁的菌體細胞)和C(再生菌體細胞)，按下式計算菌株B-1原生質(zhì)體的形成率和再生率[10]：

形成率=(A-B)/A×100%；

再生率=(C-B)/(A-B)×100%。

1.2.3菌株SC-1原生質(zhì)體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株SC-1接種于3-PBA濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基，30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。Tris-HCl緩沖液洗滌菌體2次，離心(4 ℃，12 000 r/min)10 min，Tris-HCl緩沖液重懸并調(diào)D600 nm為1.4，加入EDTA溶液，使其終濃度為10 mmol/L，37 ℃振蕩(100 r/min)20 min。SMM洗滌菌體2次，重懸于SMM，加入溶菌酶溶液，37 ℃振蕩(100 r/min)15 min，離心(4 ℃，4 000 r/min)10 min，沉淀重懸于SMM[11，12]。SMM梯度稀釋，涂布于再生培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)96～120 h。菌株SC-1原生質(zhì)體的形成率和再生率計算方法同“1.3.2”節(jié)。

1.2.4影響菌株原生質(zhì)體形成和再生的因素

1.2.4.1甘氨酸和青霉素對原生質(zhì)體形成和再生的影響分別在菌株B-1和菌株SC-1生長延滯期加入甘氨酸(終濃度為1.0 mg/mL)或在生長對數(shù)期中期加入青霉素(終濃度為2.5 U/mL)，測定并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.2.4.2溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響當菌株B-1生長至對數(shù)末期時(13 h)，分別用不同濃度的溶菌酶作用15 min；當菌株SC-1生長至對數(shù)末期(12 h)時，EDTA預(yù)處理，分別用不同濃度的溶菌酶作用20 min；測定并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.2.4.3溶菌酶作用時間對原生質(zhì)體形成和再生的影響用溶菌酶分別對菌株 B-1 和菌株SC-1作用不同時間，測定原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.2.4.4EDTA濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響分別用不同濃度的EDTA溶液對菌株SC-1進行預(yù)處理，測定并計算原生質(zhì)體形成率與再生率。

1.2.4.5穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體形成和再生的影響考察相同濃度(0.5 mol/L)穩(wěn)定劑(琥珀酸鈉、蔗糖、氯化鈉、甘露醇)的再生培養(yǎng)基分別對菌株B-1和菌株SC-1再生率的影響。

1.2.4.6原生質(zhì)體制備和再生適宜條件的確定基于上述單因素試驗結(jié)果，對原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件進行試驗確認。

1.3　數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行重復(fù)3次，使用軟件Origin 9.0和Excel 2017對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　菌株B-1和菌株SC-1的生長曲線

菌株B-1和菌株SC-1的生長曲線如圖1和圖2所示?？梢钥闯?，菌株B-1的延滯期為8 h，16 h后進入穩(wěn)定期；菌株SC-1經(jīng)過2 h的延滯期進入對數(shù)生長期，18 h后進入穩(wěn)定期。對數(shù)期菌體的生理狀態(tài)相對一致，代謝旺盛，對溶菌酶的敏感性強，有利于原生質(zhì)體形成和再生，對數(shù)期末菌體數(shù)最多，方便收集[13]，因此菌株B-1和菌株SC-1菌齡分別是13 h和12 h。

2.2　影響原生質(zhì)體形成和再生的因素

2.2.1甘氨酸和青霉素對原生質(zhì)體形成和再生的影響甘氨酸是細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)類似物，可能摻入細胞壁中，擾亂肽聚糖的相互交聯(lián)，導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)的不完整，不利于細胞的生長[13]。青霉素可能與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，抑制其側(cè)鏈末端的丙氨酸與五肽橋的連接，影響轉(zhuǎn)肽作用與肽鍵的形成，所以增強菌體對溶菌酶的敏感性，有利于細胞原生質(zhì)體的形成[14]。表1結(jié)果表明，2個菌株的培養(yǎng)過程中分別加入甘氨酸或青霉素的原生質(zhì)體形成率雖然略有提高，但是原生質(zhì)體的再生率顯著降低。

表1　甘氨酸和青霉素對菌株原生質(zhì)體形成和再生的影響

2.2.2溶菌酶濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖3可以看出，2個菌株原生質(zhì)體形成率均隨溶菌酶濃度的增加而提高，而再生率呈下降趨勢；當溶菌酶濃度為0.1 mg/mL 時，菌株B-1的原生質(zhì)體形成率(90%)和再生率(4.61%)較高；當溶菌酶濃度為3.33 mg/mL時，菌株SC-1的形成率(90.2%)和再生率(13.73%)較高；當酶濃度繼續(xù)增加，2個菌株的原生質(zhì)體形成率提高不明顯， 但原生質(zhì)體再生率顯著下降。因為溶菌酶酶解細胞壁的原因是它可以破壞細胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，濃度越高破壞效果越明顯，易導(dǎo)致脫壁過度，使其失去再生細胞壁的引物[13-14]，所以當其濃度過高時，再生率顯著降低。

2.2.3溶菌酶作用時間對原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖4可以看出，初始階段菌株B-1和菌株SC-1原生質(zhì)體形成率隨作用時間的延長迅速提高，15 min后提高緩慢，而再生率隨作用時間的延長而降低。溶菌酶作用時間短，原生質(zhì)體表面的細胞壁碎片較多，可作為細胞壁再生的引物，但作用時間過長，菌體細胞壁碎片被全部酶解，而且原生質(zhì)體容易受損，導(dǎo)致其再生困難[15]。

2.2.4EDTA濃度對原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖5可以看出，隨著EDTA濃度增加，菌株SC-1的原生質(zhì)體形成率提高，而再生率呈現(xiàn)下降趨勢。以原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積最大作為判斷原生質(zhì)體制備條件的依據(jù)[16]，EDTA預(yù)處理的適宜濃度為5 mmol/L。EDTA對菌株SC-1進行預(yù)處理可明顯提高原生質(zhì)體的形成率，因為EDTA可以通過螯合作用破壞菌株SC-1細胞壁的外膜，有利于溶菌酶與肽聚糖的接觸，提高原生質(zhì)體的形成率，但是EDTA對原生質(zhì)體具有毒害作用，隨著作用時間延長，原生質(zhì)體的再生率下降[11]。

2.2.5穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體形成和再生的影響由表2可以看出，琥珀酸鈉是菌株B-1原生質(zhì)體再生的較理想穩(wěn)定劑，其再生率(6.82%)最高；蔗糖是菌株SC-1原生質(zhì)體再生的較理想穩(wěn)定劑，再生率(26.54%)最高。穩(wěn)定劑一方面可以調(diào)節(jié)滲透壓維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定有利于再生，另一方面原生質(zhì)體可能會利用穩(wěn)定劑代謝產(chǎn)酸，導(dǎo)致再生培養(yǎng)基的pH值下降，不利于原生質(zhì)體的再生，選擇合適的穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的再生至關(guān)重要。

2.2.6原生質(zhì)體制備適宜條件的驗證基于單因素試驗結(jié)果，確定菌株B-1原生質(zhì)體制備的適宜條件為：菌齡13 h，溶菌酶濃度0.1 mg/mL，溶菌酶作用時間15 min；菌株SC-1原生質(zhì)體制備的適宜條件為：菌齡12 h，EDTA濃度 5 mmol/L，溶菌酶濃度3.33 mg/mL，溶菌酶作用時間15 min。驗證試驗結(jié)果顯示，菌株B-1原生質(zhì)體形成率為93.11%，再生率為7.22%；菌株SC-1原生質(zhì)體形成率為95.37%，再生率為27.04%。2個菌株原生質(zhì)體制備前后的顯微鏡圖像如圖6和圖7所示。可以看出，長桿狀的菌株B-1細胞和短桿狀的菌株SC-1細胞多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐巍?/p>

表2　穩(wěn)定劑對菌株B-1和菌株SC-1原生質(zhì)體再生的影響

3　結(jié)論

原生質(zhì)體制備是原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵技術(shù)之一，要制備有活性且大量的原生質(zhì)體，需要對不同菌株進行合適的處理。本研究對分離得到的地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌 SC-1 原生質(zhì)體進行研究，發(fā)現(xiàn)菌齡、溶菌酶濃度及作用時間等因素對原生質(zhì)體的形成和再生影響明顯。本研究獲得了具有活性的原生質(zhì)體，適宜條件下菌株B-1和菌株SC-1的原生質(zhì)體形成率和再生率均較高，為后續(xù)通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育β-CY高效降解菌奠定了基礎(chǔ)。

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