，　　，　，　

(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，　上海 200232；　2.伽藍(lán)(集團(tuán))股份有限公司，　上海 201401；3.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，　上海 200232)

桃(Prunspersica)為薔薇科李屬，落葉小喬木，具有較高的觀賞和食用價(jià)值。桃仁是桃的成熟種子，可入藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，“桃仁味苦平”，具有疏通淤血作用[1]。據(jù)報(bào)道，桃仁中的化學(xué)成分有脂肪油類(lèi)(油酸、亞油酸和棕櫚酸)、苷類(lèi)、氨基酸和蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、黃酮及其糖苷類(lèi)化合物等[2-3]，是一種優(yōu)質(zhì)的可利用植物資源。目前關(guān)于桃的研究較多，主要集中在種子萌發(fā)、育種、栽培、病蟲(chóng)害防治、果實(shí)品質(zhì)、貯藏保鮮等方面[4-8]，但對(duì)桃仁內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)、內(nèi)含物等方面的研究報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)利用合適的溫度條件對(duì)桃仁進(jìn)行發(fā)芽，通過(guò)顯微切片觀察種子內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并測(cè)定種子內(nèi)含物中的氨基酸含量，研究種子發(fā)芽前后主要化學(xué)成分的分布情況和變化趨勢(shì)，以期為桃仁在食品、化妝品產(chǎn)業(yè)中的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

注：1～16分別是天門(mén)冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，組氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴(lài)氨酸。圖1　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

1　材料與方法

1.1　材　料

供試材料桃仁為2016年8月采自昆明地區(qū)的野生山桃，試驗(yàn)在上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院植物生理試驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2　方　法

1.2.1種子萌發(fā)

4月份，取大小一致的成熟桃仁，用蒸餾水浸種24 h，每10粒種子放入有2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上蓋，置于不同溫度的人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度分別設(shè)定為15，20，25，30 ℃，以室溫下培養(yǎng)為對(duì)照，其他條件：光照度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，重復(fù)3次。每天記錄種子的萌發(fā)狀態(tài)和數(shù)量，計(jì)算種子發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率。

發(fā)芽指數(shù)=發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù)；

發(fā)芽率(%)=全部正常發(fā)芽的種子/供試種子總數(shù)×100%。

1.2.2內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征顯微觀察

采用樹(shù)脂切片方法。取完整的種子，將胚芽部分分割下來(lái)，為1 mm左右的小塊，先用4 %戊二醛(0.2 mol/L磷酸緩沖液配制，pH=7.2)固定，4 ℃保存。再用2 %鋨酸(0.2 mol/L磷酸緩沖液配制，pH=7.2)固定2 h，然后經(jīng)梯度乙醇脫水和純丙酮轉(zhuǎn)換后，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，樣品用半超薄切片機(jī)切片，最后用甲苯胺藍(lán)染色，干燥后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)、拍照。

1.2.3氨基酸提取物的制備及測(cè)定

氨基酸提取物的制備：取一定質(zhì)量的不同發(fā)芽階段的桃種子，研缽研碎之后轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶中，加入8倍體積的55%乙醇，500 W超聲反應(yīng)2 h，過(guò)濾，取濾液；濾渣中再加入8倍體積的55 %乙醇，500 W超聲2 h，過(guò)濾，取濾液；合并濾液后離心，取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。

衍生試劑的配置：稱(chēng)取OPA 40 mg，加入3.5 mL 的0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=10.4)， 62.5μL 的3-巰基丙酸和0.5 mL的乙腈，混合均勻。

流動(dòng)相的配置：流動(dòng)性A：乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10，體積比)。流動(dòng)性B：稱(chēng)取0.7 g NaHPO4和1.9 g Na2B4O7·10 H2O，溶于400 mL水中，加濃鹽酸調(diào)到pH=8.2，最后定容到500 mL，0.45μm濾膜過(guò)濾。

衍生反應(yīng)：衍生在Agilent 1260型高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器上在線自動(dòng)完成。程序如下： 1) 吸取15μL硼酸鹽緩沖液(pH=10.0)； 2) 吸取2.5μL樣品溶液； 3) 混合5次； 4) 等待0.2 min； 5) 吸取2.5μL的OPA試劑； 6) 混合5次； 7) 等待0.1 min； 8) 進(jìn)樣20μL。

HPLC測(cè)定：采用梯度洗脫，流速1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，柱溫40 ℃，以保留時(shí)間定性(圖1)，外標(biāo)法定量。

2　結(jié)果與分析

2.1　桃仁萌發(fā)溫度及發(fā)芽動(dòng)態(tài)觀察

山桃的種子呈卵形，種皮淡褐色，革質(zhì)光滑，種子長(zhǎng)1.20～1.40 cm，寬0.60～0.90 cm，千粒重319～354 g。在室溫條件下，經(jīng)水浸泡處理的桃仁4 d后開(kāi)始膨大萌動(dòng)，之后胚軸伸長(zhǎng)，10 d胚根生長(zhǎng)，20 d后陸續(xù)發(fā)芽，整個(gè)萌發(fā)過(guò)程可分為吸脹、萌動(dòng)、發(fā)芽3個(gè)階段(表1)。

表1不同溫度條件下桃仁發(fā)芽狀態(tài)

溫度(℃)　　階段1　　　　階段2　　　　階段3　　天數(shù)(d)發(fā)芽指數(shù)天數(shù)(d)發(fā)芽指數(shù)天數(shù)(d)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽率(%)ck43．75101．50200．5033．31554．40151．33250．6453．32055．60122．08201．0066．72547．50112．73181．4476．63047．50102．80161．5673．3

注：A為桃仁萌發(fā)前的結(jié)構(gòu)特征；B為桃仁吸脹過(guò)程的結(jié)構(gòu)特征；(放大倍數(shù)依次為5×、10×、40×)SC為種皮；E為胚；CO為子葉；pb為蛋白體； s為淀粉粒。圖2　不同萌發(fā)時(shí)期種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征

在15～30 ℃范圍內(nèi)，不同溫度條件下的桃種子均可發(fā)芽，發(fā)芽率為33.3%～76.6%，其中在25 ℃條件下的種子發(fā)芽率最高。從表1可看出，不同溫度處理對(duì)種子開(kāi)始吸脹(階段1)的時(shí)間沒(méi)有明顯的影響，時(shí)間為4～5 d；但是對(duì)種子萌動(dòng)(階段2)、發(fā)芽(階段3)時(shí)間存在一定的影響，分別10～15 d和16～25 d，溫度越高各階段間隔時(shí)間越短，其中吸脹、萌發(fā)和發(fā)芽時(shí)間最短的是30 ℃。在發(fā)芽過(guò)程中，在15 ℃條件下培養(yǎng)的種子發(fā)芽緩慢，胚根很短，表現(xiàn)不正常；30 ℃條件下發(fā)芽的幼苗生長(zhǎng)雖然較快，但胚根在萌發(fā)后期易褐化，導(dǎo)致已處于階段3的種子死亡。總體上，25 ℃條件下的種子萌發(fā)速度較快、種子發(fā)芽率高。

2.2　不同萌發(fā)時(shí)期桃仁形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

從萌發(fā)前桃仁的縱切面(圖2 A-1)觀察，可看到內(nèi)種皮、胚、子葉3個(gè)部分。內(nèi)種皮由兩類(lèi)細(xì)胞組成，一種細(xì)胞體積較小，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大的空泡，細(xì)胞之間有黑色顆粒狀物質(zhì)，明顯地構(gòu)成了內(nèi)種皮的內(nèi)層，為1～2層細(xì)胞；另一種細(xì)胞體積較大，細(xì)胞中的內(nèi)含物染色較深，由多層細(xì)胞構(gòu)成。胚細(xì)胞呈現(xiàn)胚性細(xì)胞的典型特征，小而致密，細(xì)胞質(zhì)濃厚，核大(圖2 A-2)。子葉細(xì)胞發(fā)育完全，細(xì)胞排列規(guī)則，所貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分較多，有利于胚的發(fā)育，子葉中含量較多的物質(zhì)結(jié)構(gòu)是淀粉粒和蛋白體，淀粉粒多呈不規(guī)則型，通常每個(gè)細(xì)胞中含有1～4個(gè)淀粉顆粒；蛋白體多呈近圓球形，分布在淀粉顆粒之間的空隙內(nèi)(圖2 A-3)。

桃仁浸種后，種子處于吸脹過(guò)程，體內(nèi)開(kāi)始發(fā)生變化。從圖2 B-1、圖2 B-2可以明顯看出，胚細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，胚芽形成；胚根開(kāi)始伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。種子內(nèi)部?jī)?chǔ)存淀粉粒和蛋白體等大分子開(kāi)始被水解，分解成可溶性的小分子(圖2 B-3)。

2.3　桃仁內(nèi)含物中氨基酸含量變化

對(duì)萌發(fā)過(guò)程中的桃仁進(jìn)行16種氨基酸含量測(cè)定(表2)，在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中精氨酸含量最高，為0.10%～1.46%；其次為谷氨酸含量，為0.06%～0.74%；蛋氨酸，甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等7種氨基酸含量較低，為0.01%～0.05%。

從氨基酸總含量和種類(lèi)隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程不斷增加。萌發(fā)前的氨基酸總量最低，為0.26%，各氨基酸成分含量范圍為0.00%～0.10%，并且只檢測(cè)到9種氨基酸，其中精氨酸含量最高，為0.10%，其次為谷氨酸(0.06%)、苯丙氨酸(0.04%)、甘氨酸(0.02%)，天門(mén)冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、纈氨酸均為0.01%。萌發(fā)階段1的氨基酸總量為1.86%，檢測(cè)到除了酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸以外的12種氨基酸種類(lèi)，其中谷氨酸含量最高，為0.74%。萌發(fā)階段2的氨基酸總量為2.63%，同時(shí)檢測(cè)到了所有16種氨基酸種類(lèi)。萌發(fā)階段3的氨基酸含量最高，為3.10%，檢測(cè)到除蛋氨酸以外的15種氨基酸種類(lèi)。

從同一氨基酸不同的萌發(fā)階段來(lái)看，多數(shù)氨基酸含量隨著桃仁種子的萌發(fā)進(jìn)程不斷增加，其高峰值處于萌發(fā)階段3。而天門(mén)冬氨酸、谷氨酸含量的高峰值處于第1階段，之后逐漸降低；丙氨酸含量高峰值處于第2階段，第3階段含量降低；賴(lài)氨酸的含量在第1階段達(dá)到最高值，之后含量始終保持在0.17%；蛋氨酸含量在萌發(fā)前后差異較小，最高值是第2階段，為0.01%。

表2不同發(fā)芽階段桃仁內(nèi)含物中氨基酸含量(%)

編號(hào)氨基酸萌發(fā)前階段1階段2階段31天門(mén)冬氨酸0．010．250．210．202谷氨酸0．060．740．590．363絲氨酸0．010．070．160．204組氨酸0．010．040．080．165甘氨酸0．020．020．050．046蘇氨酸0．000．010．030．047精氨酸0．100．300．931．468丙氨酸0．020．100．150．129酪氨酸0．000．000．020．0410胱氨酸0．000．000．020．0211纈氨酸0．010．040．040．0512蛋氨酸0．000．000．010．0013苯丙氨酸0．040．090．120．1314異亮氨酸0．000．000．030．0415亮氨酸0．000．020．040．0516賴(lài)氨酸0．000．170．170．17總和0．261．862．633．10

3　討　論

桃種子有休眠現(xiàn)象，加上存在堅(jiān)硬的內(nèi)果皮，常出現(xiàn)爛種或隔年發(fā)芽現(xiàn)象，田間播種發(fā)芽率往往很低[9]。為了充分利用桃仁中的天然有效成分，同時(shí)便于后期的提取利用，本研究在播種前去掉核殼，利用可控的人工智能氣候箱對(duì)桃仁進(jìn)行不同溫度條件下的發(fā)芽試驗(yàn)。經(jīng)水浸泡處理的桃仁4 d后開(kāi)始膨大萌動(dòng)，之后胚軸伸長(zhǎng)，胚根生長(zhǎng)，陸續(xù)發(fā)芽，整個(gè)萌發(fā)過(guò)程可分為吸脹、萌動(dòng)、發(fā)芽3個(gè)階段，并以25 ℃條件下的種子萌發(fā)速度較快、種子發(fā)芽率高，為76.6%，與張桂兵等[10]用層積法、開(kāi)水燙種法處理毛桃種子得到的出苗率差異不大。

從顯微結(jié)構(gòu)來(lái)看，桃仁的經(jīng)過(guò)前期浸種處理后，最明顯的變化就是胚細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，胚芽形成，胚根開(kāi)始伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；細(xì)胞內(nèi)大量的淀粉粒和蛋白體等物質(zhì)被降解。種子在萌發(fā)的過(guò)程中，種胚從生命活動(dòng)相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，恢復(fù)到生理代謝旺盛的生長(zhǎng)發(fā)育階段，體內(nèi)的儲(chǔ)藏物質(zhì)被轉(zhuǎn)化和利用[11]。這與油松(Pinustabuliformis)[12]、銀杏(Ginkgobiloba)[13]、番茄(Lycopersiconesculentum)[14]種子在萌發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出相似的情況，物質(zhì)的降解與幼胚的生長(zhǎng)同步進(jìn)行，兩者具有密切的聯(lián)系。

另外，氨基酸及其衍生物易被皮膚吸收，使老化和硬化的表皮恢復(fù)彈性，延緩皮膚衰老[15]。在桃仁萌發(fā)過(guò)程中，貯藏蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下逐漸分解為氨基酸，氨基酸含量和種類(lèi)隨著種子的萌發(fā)進(jìn)程不斷增加。從氨基酸含量來(lái)看，精氨酸含量最高，為0.10%～1.46%，其次為谷氨酸含量，為0.06%～0.74%，蛋氨酸，甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等7種氨基酸含量較低，為0.01%～0.05%，這些對(duì)于后期桃仁中氨基酸含量的提取和利用提供了理論依據(jù)。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄、戴燚)