喬清華 ，張傳云 ，袁哲誠 ，王芙蓉 *，張軍

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250100；2.山東棉花研究中心/農(nóng)業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點實驗室，濟(jì)南250100）

1904年德國生物學(xué)家Hiltner首先提出根際的概念[1]，根際是根周圍受根影響的1個小區(qū)域內(nèi)的土壤[2-3]。根際是植物和數(shù)百萬計的土壤微生物相互作用的主要場所[4]，是植物-土壤-微生物相互作用，并且進(jìn)行物質(zhì)能量交換和信號交流的1個重要的界面。根際微生物可以通過改變植物細(xì)胞代謝過程中的滲透作用、信號交流、酶的活性等影響植物的生長發(fā)育和生物非生物脅迫抗性[5-8]。例如根際促生菌可以直接或者間接為植物提供生長發(fā)育所需的磷和氮[9-13]，分泌植物激素調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[14-17]，提高植物對生物和非生物脅迫的抵抗能力[18-20]。另一方面，植物本身通過落葉、根系分泌物等形式向土壤中輸入物質(zhì)能量和信號調(diào)節(jié)根際環(huán)境，從而改變根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[21]。研究表明，植物通過光合作用固定的碳至少有21%通過根系分泌物等方式輸入到土壤中，從而影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)[22]。已經(jīng)有大量的研究表明，植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)受生長環(huán)境、品種特性和發(fā)育時期等多種因素的影響[23-25]。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是天然纖維的主要來源。連作障礙引發(fā)的棉花大面積減產(chǎn)在我國主產(chǎn)棉區(qū)普遍存在。連作障礙是植物-土壤-微生物之間長期相互作用的結(jié)果。了解連作土壤中棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，對人工干預(yù)棉花根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、適當(dāng)調(diào)整棉花的生理周期、提高棉花對土傳性致病菌的抗性或抑制土傳致病菌的定殖具有重要意義。本研究利用高通量測序技術(shù)對多年棉花連作土中棉花不同發(fā)育時期的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析連作土壤中不同發(fā)育時期的棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點，探明連作土壤中棉花根際細(xì)菌群落的動態(tài)變化規(guī)律，為克服連作障礙、促進(jìn)棉花生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

棉花材料選用陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室張?zhí)煺娼淌谔峁?/p>

棉花多年連作土取樣于山東棉花研究中心臨清試驗站棉田地表以下15～30 cm處土層。為了使大田土土質(zhì)疏松易于取樣，將大田土與滅菌后的細(xì)砂以質(zhì)量比2∶1混勻后使用。

1.2　棉花種植和取樣

種子脫絨后用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的過氧化氫浸泡1 h進(jìn)行消毒，然后用滅菌水反復(fù)沖洗3～5次。再用滅菌水浸泡12 h左右，種子吸足水后將其移至鋪有滅菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，28℃避光培養(yǎng)12～24 h。種子萌發(fā)后種植到裝有大田土的花盆中放于28℃組培室育苗。待幼苗破土后轉(zhuǎn)移到預(yù)先消毒過的溫室中培養(yǎng)。每3 d澆1次滅菌水，幼苗期每次每盆500 mL，蕾期和花期每次每盆1 000 mL。

分別在幼苗期、蕾期、花期取樣。將花盆倒扣，倒出土后輕輕抖動棉株，抖落多余的土壤，留下附著在根表面1 mm左右的根際土。將根剪下放于裝有滅菌水的50 mL離心管中，用滅菌水反復(fù)沖洗后取出根，將根際土混懸液以104r·min－1離心15 min，倒掉上清液，沉淀液經(jīng)液氮速凍，于－80℃冷凍備用。非根際土為不種植棉花的花盆中距土表6～15cm的土壤。每個處理3個重復(fù)。

1.3　DNA提取與測序分析

所獲取的土壤樣品DNA提取、檢測和樣品檢測合格后建庫測序以及下機數(shù)據(jù)過濾分析由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

數(shù)據(jù)過濾采取按窗口去低質(zhì)量的方法，設(shè)置30 bp為窗口長度，如果窗口平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截除末端序列，移除最終長度低于原始長度75%的片段；去除接頭污染的片段（接頭序列與片段序列有15 bp的重疊，允許錯配數(shù)為3；去除含N的片段；去除低復(fù)雜度的片段（片段中某個堿基連續(xù)出現(xiàn)的長度≥10 bp）。

序列拼接使用軟件FLASH （Fast length adjustment of short reads，V1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對片段組裝成1條序列。最小匹配長度為15 bp，重疊區(qū)域允許錯配率為0.1。

利用軟件 USEARCH（V7.0.1090）將拼接好的片段聚類為運算分類單位 （Operational taxonomic unit，OTU)。得到OTU代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫（Greengene）比對進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.5。根據(jù)OTU在每個樣品的豐度文件，計算每個樣品或組別具有的OTU（不考慮OTU豐度，只考慮 OTU有無），通過 R語言（V3.0.3）中的VennDiagram包制作Venn圖，并找出樣品間或組間共有與特有的OTU。

α多樣性指數(shù) Observed species(Sobs)、Chao、Shannon稀釋曲線是利用已測得序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得Reads序列總數(shù)）Tags時各Alpha指數(shù)的期望值，然后根據(jù)1組n值（一般為1組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列，本項目公差為1 000）與其相對應(yīng)的Alpha指數(shù)的期望值繪制曲線。通過mothur軟件（V1.31.2）計算樣品的Alpha多樣性指數(shù)值并用R軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線圖。計算公式參考：http://www.mothur.org/wiki/Calculators.

Beta多樣性通過QIIME（V1.80）進(jìn)行。由于不同樣品的測序深度不一樣，需要對每個樣品的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)一。每個樣品按所有樣品中序列數(shù)最少的樣品的序列數(shù)隨機抽取序列，生成新的OTU table biom文件，并用該文件計算Beta多樣性距離。

2　結(jié)果與分析

2.1　測序結(jié)果

圖1　根際和非根際細(xì)菌共有和特有的OTU數(shù)目Fig.1　Common and special OTU numbers between rhizosphere and bulk soil bacterial community

在苗期、蕾期、花期收集棉花根際土和非根際土，利用Illumina MiSeq平臺對土壤中的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增并測序。共得到2 037 056對高質(zhì)量的reads，組裝成2 025 475條tags。拼接后的序列經(jīng)過優(yōu)化后在97%的相似度下聚類為11 336個用于物種分類的OTU （表S1；注：表S1～7和圖S1～2請參見本刊網(wǎng)站電子版，印刷版省略）。根際細(xì)菌OTU數(shù)量極顯著高于非根際（P＜0.01），并且隨著發(fā)育時期的變化，棉花根際細(xì)菌的特異性O(shè)TU比例逐漸增加（圖1），花期根際特有的OTU數(shù)量最高。不同發(fā)育時期之間的根際細(xì)菌OTU數(shù)量沒有顯著差異。

2.2　棉花不同發(fā)育時期根際微生物的群落組成

圖2　棉花不同發(fā)育時期根際和非根際樣品中細(xì)菌群落組成Fig.2　Bacterial community composition in rhizosphere and bulk soil during different development stage

棉花不同發(fā)育時期根際細(xì)菌各門的相對豐度存在差異，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉 菌 門 （Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）這4門細(xì)菌的豐度占整個細(xì)菌群落的73.25%～77.20%，在各時期棉花根際細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位，其中變形菌門的相對豐度遠(yuǎn)高于其他菌門，為30.44%～32.34%（圖2、表S2）。每個菌門的主導(dǎo)菌綱或主導(dǎo)菌目（相對豐度＞1%）在不同發(fā)育時期的根際土中相同。其中酸桿菌門的主導(dǎo)菌綱為Chloracidobacteria、Acidobacteria-6，約占酸桿菌門的 14.28%～15.00%；擬桿菌門的主導(dǎo)菌綱為Saprospirae、Cytophagia，約占擬桿菌門的8.94%～10.23%；浮霉菌門的主導(dǎo)菌綱為 Planctomycetia、Phycisphaerae，約占浮霉菌門的13.97%～15.21%；變形菌門的主導(dǎo)菌綱為 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria，約為變形菌門的30.22%～32.18%（表 S3）。

酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門、變形菌門在根際與非根際土中的相對豐度存在顯著差異且差異較大（P＜0.05，平均差值＞0.03），為根際和非根際細(xì)菌群落中的主要差異菌門（表S2）。與非根際土相比，厚壁菌門、變形菌門在根際土中的相對豐度顯著降低，其他菌門相對豐度顯著升高。并且各菌門相對豐度升高或降低程度不同。例如3個時期平均酸桿菌門在根際土中的相對豐度比非根際土中高0.083 4±0.018 6，而擬桿菌門在根際土中的相對豐度比非根際土中高0.031 4±0.012 1。厚壁菌門在根際土中的相對豐度比非根際土中低0.1117±0.0070，變形菌門在根際土中的相對豐度比非根際土中低0.114 0±0.008 4（表 S2）。

與非根際土相比，棉花根際土中各菌屬相對豐度增加或降低量存在差異。我們對與非根際土相比相對豐度顯著增加或降低的菌屬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Candidatus_Nitrososphaera、Steroidobacte等菌屬在根際土中的相對豐度顯著高于非根際土（P＜0.05）， 而Lactococcus、Rhodoplanes等菌屬在根際土中的相對豐度顯著低于非根際土。我們分析了在不同發(fā)育時期根際土中受到棉花根系的促進(jìn)且與非根際土相比相對豐度差值較大的菌屬（表1），發(fā)現(xiàn)3個發(fā)育時期受到顯著促進(jìn)作用的菌屬基本相同。但是不同菌屬受到的促進(jìn)作用隨發(fā)育時期的變化不同，例如Candidatus_Nitrososphaera、Steroidobacter、Planctomyces等菌屬在根際與非根際土中的相對豐度差值隨發(fā)育時期的變化逐漸升高，而Rubrivivax、Niastella在根際與非根際土中的相對豐度差值則隨發(fā)育時期的變化逐漸降低，Novosphingobium、Chitinophaga在根際與非根際土中的相對豐度差值在蕾期最高。棉花對細(xì)菌的抑制作用在花期相對較弱。在花期根際土中相對豐度升高的菌屬數(shù)量高于相對豐度降低的菌屬數(shù)量（表S4）。

2.3　棉花不同發(fā)育時期的根際細(xì)菌α-多樣性變化

用 Observed species（Sobs）、Chao 以及 Shannon指數(shù)衡量不同土壤的α-多樣性。其中Sobs、Chao可以反映群落中物種的豐富度，而Shannon受群落中物種豐富度（Species richness）和物種均勻度 （Species evenness）的影響。此外，Sobs和Chao指數(shù)對應(yīng)的稀釋曲線還可以反映樣品測序深度是否已經(jīng)基本覆蓋樣品中所有的物種。由稀釋曲線可以看出本試驗的測序深度符合要求（表S5，圖 S1、S2）。

由結(jié)果可以看出，棉花根際細(xì)菌群落的α-多樣性極顯著大于非根際土（P＜0.01）。棉花不同發(fā)育時期的根際細(xì)菌α-多樣性隨著發(fā)育時期變化逐漸降低，但是差異不顯著（P＞0.05）。棉花根際和非根際細(xì)菌的Sobs和Chao指數(shù)在花期低于蕾期，而根際細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)花期高于蕾期，非根際細(xì)菌Shannon指數(shù)低于蕾期，推測棉花在花期對根際細(xì)菌的均勻度有促進(jìn)作用（表 S6）。

2.4　棉花不同發(fā)育時期根際細(xì)菌的β-多樣性

為了比較不同土壤樣品間的細(xì)菌群落多樣性差異，我們用Bray-Curtis指數(shù)對樣品的β-多樣性進(jìn)行分析。Bray-Curtis距離是反映2個群落之間差異性的常用指標(biāo)，不考慮序列間的進(jìn)化距離，只考慮2個樣品中物種的存在性。Bray-Curtis值越大，表示2個樣品間β-多樣性越大。

對樣品間多樣性分析表明，不同發(fā)育時期根際細(xì)菌群落間存在差異（表S7）。棉花根際與非根際之間的細(xì)菌群落多樣性差異隨著發(fā)育時期的變化極顯著升高（P＜0.01，圖4A），花期與蕾期的根際細(xì)菌群落差異顯著大于蕾期與苗期（P＜0.05，圖4B）。說明棉花對根際微生物的影響隨著發(fā)育時期的變化逐漸增加，在花期對根際細(xì)菌群落的影響比苗期和蕾期大。

表1　各發(fā)育時期顯著受棉花根系促進(jìn)和抑制的菌屬Table 1　Bacterial genera inhibited or promoted by cotton root in each development stages %

3　討論

3.1　棉花根際細(xì)菌群落組成及其與非根際細(xì)菌群落之間的差異

圖3　棉花不同發(fā)育時期根際和非根際土壤中Sobs、Chao以及Shannon指數(shù)變化Fig.3　Change of Sobs,Chao and Shannon indexes in rhizosphere and bulk soil during different development stages

圖4　棉花不同發(fā)育時期根際與非根際細(xì)菌群落間β-多樣性和不同發(fā)育時期間的β-多樣性比較Fig.4　β-diversity between rhizosphere and bulk soil in different development stages and β-diversity between different development stages

已有研究表明，植物可以與土壤和微生物相互作用，通過改變土壤的理化性質(zhì)，釋放根系分泌物等方式與根際微生物進(jìn)行復(fù)雜的相互作用，調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)，形成其特有的根際微生物。本研究結(jié)果表明，在棉花多年連作土壤中變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、擬桿菌門這4大菌門為棉花根際細(xì)菌群落的主導(dǎo)菌門，并且在不同發(fā)育時期每個菌門的主導(dǎo)菌綱相同。其中變形菌門為常見的土壤中相對豐度較高的菌門，其相對豐度遠(yuǎn)高于其他菌門。酸桿菌門是廣泛存在于植物根際的主導(dǎo)菌門，能夠降解多糖，所以可能在植物根際的碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用[26]。浮霉菌門可能與氨的氧化有關(guān)[27]，但是并不是植物根際細(xì)菌群落中常見的主導(dǎo)菌門。與其他植物相比，浮霉菌門在棉花根際土壤中的相對豐度較高，可能與棉花的某些生理特性有關(guān)。棉花根際與非根際細(xì)菌群落差異主要集中在4個主導(dǎo)菌門和厚壁菌門這5個菌門，并且酸桿菌門、擬桿菌門、浮霉菌門受到棉花根系促進(jìn)，在根際土中的相對豐度高于非根際土，而厚壁菌門、變形菌門受到棉花根系抑制，在根際土中的相對豐度低于非根際土。這與之前的研究結(jié)果——長期連作土壤中厚壁菌門受到植物根系的顯著抑制一致[28]。Dombrowski猜測，在寄主植物根系中豐度普遍升高的菌種是對寄主植物有特殊促進(jìn)作用的菌種[29]。因此，我們推測酸桿菌門、擬桿菌門、浮霉菌門中的某些菌群對棉花生長發(fā)育有促進(jìn)作用。

3.2　多年棉花連作大田土中棉花根際細(xì)菌群落的多樣性高于非根際

已有研究表明，棉花連作導(dǎo)致土壤肥力下降，土壤酶活力、細(xì)菌群落物種豐富度降低[30-31]。張偉等的研究表明，棉花長期連作使土壤中的細(xì)菌群落物種豐富度降低，而多樣性和均勻度指數(shù)增大[32]。本研究表明，與非根際土相比，棉花根際細(xì)菌群落的物種豐富度顯著增加，并且豐度受到促進(jìn)的菌屬數(shù)量遠(yuǎn)高于受到抑制的菌屬數(shù)量。推測多年棉花連作土壤中的微生物由于受到棉花根系長期的選擇作用，其物種豐富度降低；多年棉花連作大田土中的細(xì)菌群落主要由受棉花根系促進(jìn)的菌屬組成，所以多年棉花連作大田土中的棉花根際土壤中細(xì)菌群落多樣性高于非根際土，這與Li等對黑胡椒連作土壤中根際和非根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究結(jié)果一致[28]。

3.3　發(fā)育時期對棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

Baudoin等認(rèn)為隨著植物發(fā)育時期的變化，植物向土壤中輸入的根系分泌物的數(shù)量和質(zhì)量存在差異，導(dǎo)致植物不同發(fā)育時期根際微生物的差異[33]。隨后不斷有研究結(jié)果證明植物根際微生物受發(fā)育時期顯著影響[34-36]。我們的研究結(jié)果表明，多年連作大田土中棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)受棉花發(fā)育時期顯著影響。不同菌屬在棉花根際受到促進(jìn)或者抑制，其在根際與非根際土中的相對豐度差值大小隨發(fā)育時期的變化而不同。推測每個發(fā)育時期受到促進(jìn)或抑制作用較大的菌屬可能與這個時期特殊的棉花生長發(fā)育生理特性有關(guān)。β-多樣性分析表明，隨著發(fā)育時期的變化，棉花對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越來越大，并且棉花蕾期與花期根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異大于苗期與蕾期根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。我們推測棉花花期的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他2個時期相比差異較大，可能是該時期棉花根系對細(xì)菌的選擇作用降低造成的。

棉花連作是我國棉區(qū)的主要耕作方式。土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的多樣性降低程度是衡量連作障礙的重要指標(biāo)。土壤微生物在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抵御生物和非生物脅迫等過程中都有非常重要的作用。所以了解棉花在連作條件下的根際微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化可為將來人為干涉棉田微生物群落結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，且對生物有機肥料的開發(fā)和利用、減少化學(xué)農(nóng)藥和化肥的使用、保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)有重要意義。

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