段珊 ，竇玲玲 ，程帥帥 ，郭亞寧 ，龐朝友 ，馬啟峰 ，魏恒玲 ，范術(shù)麗 ，王寒濤，喻樹迅*

（1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊陵712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

植物microRNA （miRNA）是1類長度約為21 nt的內(nèi)源性無編碼功能的單鏈小分子RNA[1]，通過降解靶基因或抑制其翻譯在轉(zhuǎn)錄后的水平上調(diào)節(jié)基因表達[2]，從而廣泛參與植物生長發(fā)育的一系列重要進程，包括調(diào)控根的形成和發(fā)育、葉形態(tài)發(fā)生和極性及植物幼年期到生殖期轉(zhuǎn)變。同時，miRNA在植物對外界環(huán)境應答和非生物脅迫方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。

棉花是我國最重要的經(jīng)濟作物之一,葉片是棉花最重要的源器官，葉片早衰嚴重影響棉產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，進而造成棉花減產(chǎn)[4]。葉片衰老是葉片發(fā)育的最后階段，多種激素參與了這一過程的調(diào)控，乙烯[5]、脫落酸[6]、茉莉酸[7]和水楊酸[8]可加速葉片衰老，細胞分裂素[9]、生長素[10]和赤霉素[11]則延緩葉片衰老。

miR160在植物的發(fā)育過程中起到了重要的調(diào)控作用。在擬南芥中，miR160通過靶向調(diào)控ARF10、ARF16和ARF17，參與調(diào)控植物生長發(fā)育及生物脅迫等[12]。在大豆中，過表達gm-MIR160A可增加葉綠素含量，同時其靶基因GmARF和衰老標記基因下調(diào)，表明gma-miR160通過抑制靶基因表達對葉片的衰老進程進行負調(diào)控[13]。將普通野生稻MIR160f前體轉(zhuǎn)入擬南芥，可使蓮座葉數(shù)目減少，首次抽薹時間提前，表明MIR160f可能參與了植物花期的調(diào)控[14]。而在龍眼中，miR160及其靶基因不僅參與激素信號傳導，還參與體細胞胚胎發(fā)生過程[15]。番茄的miR160a通過抑制其靶基因SLARF10可影響葉片的長出和早期果實的發(fā)育[16]。

棉屬A組、D組和AD組基因組測序已經(jīng)完成[17-19]，可通過 psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）預測miR160的靶基因。經(jīng)分析其為核酸外切體組分RRP41-like（Ribosomal RNA-processing protein 41），它的功能需要進一步驗證。

本研究利用擬南芥內(nèi)源miR319a前體骨架[20]，構(gòu)建了棉花miR160的過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入擬南芥等方法，初步明確了ghr-miR160的作用，以期為棉花葉片衰老相關(guān)基因的研究提供新思路。

1　材料與方法

1.1　材料

棉花miR160及其靶基因GhRRP41L在葉片中的相對表達量分析所用材料為早熟早衰品種中棉所10號 （CCRI 10）和早熟不早衰品種遼4086（Liao 4086），種植于中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所（河南省安陽市）溫室。擬南芥為哥倫比亞型，于本實驗室溫室種植，生長條件為22℃，16 h光照、8 h黑暗。pMD19-T載體購于TAKARA公司，pBI121載體為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α購于北京全式金有限公司，農(nóng)桿菌菌株LBA4404A為本實驗室保存。

1.2　取樣方法

棉花子葉展平后，開始進行第1次取樣，每隔1周取1次葉片，共取4次樣，3個重復，于液氮中速凍后存于－80℃冰箱備用。

1.3　DNA及RNA提取

采用改良的CTAB法提取擬南芥基因組DNA[21]，并將其保存于－20℃冰箱備用。使用Small RNA Purification Kit（Sigma）進行 microRNA的提取，按照TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金公司）說明書進行反轉(zhuǎn)錄，microRNA及cDNA存于－20℃冰箱備用。RNA的提取參照多糖多酚類RNAprep pure plant kit（天根生化科技有限公司）說明書，應用微量分光光度計和1%（質(zhì)量分數(shù)）瓊脂糖凝膠進行濃度和質(zhì)量檢測，合格的樣品使用 PrimeScriptRT reagent kit（TaKaRa）合成 cDNA模板后，于－20℃保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應 （Quantitative reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR）。

1.4　MicroRNA160過表達載體的構(gòu)建

從 miRBase （http://www.mirbase.org/，release 21）獲取擬南芥pre-miR319a序列，將ath-miR319a和ath-miR319a*替換為ghr-miR160和ghr-miR 160*，再從擬南芥pre-miR319a上下游各取80 bp堿基，新的序列送于蘇州金唯智生物科技有限公司合成。以合成序列為模板，用AtmiR319a引物及 Mighty Amp○RDNA Polymerase Ver.2（TaKaRa）酶獲得所需序列后，回收目的片段并連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，用菌液PCR方法鑒定獲得陽性克隆，送至金維智公司進行測序。

對序列正確的菌液提取質(zhì)粒檢測后與經(jīng)過雙酶切 （酶切位點分別是BamHⅠ和SacⅠ）的pBI121載體進行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用測序驗證正確的大腸桿菌重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

1.5　MicroRNA160過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥

利用Bechtold等建立的蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[22]。待種子成熟后收獲，為T0種子，消毒滅菌后種于具卡那霉素抗性的1/2 MS培養(yǎng)基，于4℃冰箱春化2 d后，移至16 h光照、8 h黑暗，21℃的培養(yǎng)箱中，生長14 d后，將其移栽至營養(yǎng)土中。待擬南芥生長約40 d，取蓮座葉進行PCR檢測，分單株收獲陽性株，為T1種子，以此類推，直至T3純合株系。選取陽性純合株系，進行g(shù)hr-miR160的轉(zhuǎn)錄水平分析及表型觀察。

表1　引物序列Table 1　The primer sequences in this study

1.6　qRT-PCR分析

利用軟件Oligo7設計熒光定量引物（表1），以棉花葉片和擬南芥葉片的cDNA為模板，使用康為世紀的試劑盒UltraSYBR mixture with ROX在ABI7500 Real-time PCR system熒光定量儀上進行qRT-PCR分析，反應條件為3步法，擴增程序為：預變性 95℃ 10 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；72℃32 s；40個循環(huán)。每個樣品技術(shù)重復3次，采用 2-△△Ct法，內(nèi)參基因為GhU6 和GhActin。

2　結(jié)果與分析

2.1　MicroRNA160家族分析

在miRBase中共獲得pre-miR160數(shù)據(jù)141條，miR160數(shù)據(jù)150條，分布在19個物種共41種植物中。利用DNAMAN對150條miR160數(shù)據(jù)進行多重序列比對 （圖1-A），以棉花miR160為例，第11位、14位和16位的C、G和A堿基在所有miR160中高度保守。利用DNAMAN和i-TOL（http://itol.embl.de/index.shtml） 對 141 條pre-miR160數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)進化分析 （圖1-B），結(jié)果表明，棉花 miR160 和甜橙（Citrus sinensis）、木薯（Manihot esculenta）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果楊（Populus trichocarpa）及番木瓜（Carica papaya）的miR160具有較高的同源性。

2.2　棉花miR160的表達模式分析

葉片衰老最顯著的變化是顏色由綠變黃，且葉片顏色越黃，衰老程度越嚴重[23]。觀察CCRI 10和 Liao 4086 在 4 個時期（7 d、21 d、35 d、49 d）的子葉表型，CCRI 10子葉生長35 d時顏色明顯變黃，而同時期Liao 4086子葉并無明顯的黃化表型（圖2-A）。因此，此時期CCRI 10的衰老程度比Liao 4086更為嚴重。qRT-PCR測定ghr-miR160（圖 2-B）及其靶基因GhRRP41L（圖2-C）的相對表達量表明，在35 d的Liao 4086子葉中g(shù)hr-miR160表達量上調(diào)，GhRRP41L表達量下調(diào)，說明ghr-miR160可能通過作用于靶基因延緩子葉的衰老。

圖1　miR160多重序列比對及進化關(guān)系分析Fig.1　Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of miR160 family

圖2　棉花miR160及其靶基因GhRRP41L在CCRI 10和Liao 4086不同時期子葉中的相對表達量Fig.2　qRT-PCR analysis of ghr-miR160 andGhRRP41Lin CCRI 10 and Liao 4086 at different development stages

2.3　棉花miR160的功能驗證分析

提取轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥株系LR-1、LR-2、LR-3和野生型擬南芥葉片的 DNA和RNA，進行PCR驗證和表達量分析。在DNA水平，轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥的條帶和陽性質(zhì)粒條帶位置相同，而陰性對照和野生型擬南芥無條帶（圖3-A），說明ghr-miR160基因已經(jīng)插入擬南芥基因組中；在RNA水平，ghr-miR160在轉(zhuǎn)該基因擬南芥株系中表達量顯著上調(diào)45～390倍（圖3-B），說明ghr-miR160已在擬南芥中轉(zhuǎn)錄表達。表型觀察結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥比野生型擬南芥要晚抽薹，晚開花，葉片衰老延緩（圖 4-A）。 分別取生長 20 d、30 d、40 d和 50 d的轉(zhuǎn)ghr-miR160基因和野生型擬南芥蓮座葉，測定擬南芥衰老相關(guān)基因SAG12的表達量，同時測定葉綠素。結(jié)果表明，在擬南芥衰老進程中，SAG12的表達量總體呈逐漸上升趨勢，在擬南芥生長的40 d和50 d，轉(zhuǎn)該基因擬南芥SAG12的表達量低于野生型擬南芥（圖4-B）。然而，擬南芥葉綠素含量隨著葉片衰老總體呈下降趨勢，在生長40 d和50 d時，轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥的葉綠素含量高于野生型擬南芥（圖4-C）。

圖3　轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性檢測和ghr-miR160表達量變化Fig.3　The checking of transgenicArabidopsisby PCR and qRT-PCR of ghr-miR160

3　討論

葉片衰老是植物葉片發(fā)育的最后階段，在衰老過程中，葉綠素喪失，大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂類、核酸等被降解，導致光合作用減弱，同時衰老組織的營養(yǎng)物質(zhì)被運輸?shù)接啄劢M織和生殖器官中[24]。棉花葉片衰老是1個普遍性的問題，發(fā)生于各國的產(chǎn)棉區(qū)，導致棉花減產(chǎn)降質(zhì)[4]。目前對于棉花葉片衰老的研究主要集中在生理生化指標上；因此，研究棉花早衰過程中的關(guān)鍵基因具有重要意義。

根據(jù)Zhang等[25]對71個物種37個miRNA家族研究表明，至少存在于10個不同物種的miRNA家族是高度保守的。本研究發(fā)現(xiàn)植物miR160基因在進化上高度保守，這與Zhang等[25]的研究一致。保守的miRNA基因往往形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，功能具有多樣性[26]。在所有miR160分布中，玉米（Zea mays）、亞麻（Linum usitatissimum）、 小立碗蘚 （Physcomitrella patens）、 木薯（Manihot esculenta）中分別發(fā)現(xiàn) 13 個、10 個、9 個和 8 個；而在菊芋（Helianthus tuberosus）、向日葵（Helianthus annuus）和小麥（Triticum aestivum）中分別發(fā)現(xiàn)1個。由此可見，miR160在低等植物和高等植物中都存在，是1個相對古老的家族；但是各個植物之間的存在數(shù)量有明顯差別，說明miR160基因在進化中，有些舊的基因消失，也有些新的基因出現(xiàn)，導致其在基因組呈分散分布，也進一步說明miR160家族調(diào)控的復雜性和研究價值。

為了探究棉花miR160的表達模式，本研究利用qRT-PCR分析了CCRI 10和Liao 40864各時期子葉的ghr-miR160及靶基因GhRRP41L的表達量。ghr-miR160在Liao 4086在子葉生長35 d中表達量顯著高于CCRI 10。Xu等[27]也發(fā)現(xiàn)在水稻灌漿后期，miR160在不早衰品種的葉片中優(yōu)勢表達。這表明ghr-miR160可能調(diào)控棉花葉片的衰老。

目前，對于miR160的研究主要集中于其在種子萌發(fā)、根冠發(fā)育及響應逆境等方面的作用[12]。為了進一步驗證miR160在葉片衰老中的功能，用ghr-miR160過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥。在葉片衰老過程中，一些基因被激活，表達增強，此類基因為衰老相關(guān)基因[28]。qRT-PCR檢測擬南芥衰老相關(guān)基因SAG12表達量結(jié)果顯示，生長40 d的野生型擬南芥的SAG12表達量約為轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥的2倍，而至50 d時高達5倍。并且擬南芥生長40 d、50 d時，轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥葉綠素含量約為野生型擬南芥的18倍。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥的衰老速度遠遠低于野生型擬南芥。張停停[29]發(fā)現(xiàn)miR160的靶基因ARF16突變體可使擬南芥提前衰老。以上研究表明，miR160負調(diào)控葉片衰老。

4　結(jié)論

通過對ghr-miR160進行生物信息學分析、棉花子葉表達模式分析及過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥驗證分析，結(jié)果表明：其在進化過程中高度保守，且在35 d的早熟不早衰品種遼4086子葉中優(yōu)勢表達；轉(zhuǎn)該基因擬南芥出現(xiàn)晚抽薹、晚開花和葉片衰老延遲現(xiàn)象。測定擬南芥葉片SAG12相對表達量和葉綠素含量結(jié)果進一步表明，轉(zhuǎn)該基因擬南芥出現(xiàn)衰老延緩現(xiàn)象。以上結(jié)果初步證明棉花miR160基因可能對葉片衰老過程進行負調(diào)控，為miRNA在葉片衰老進程中發(fā)揮調(diào)控作用機制提供了新的思路，也為棉花分子育種提供了潛在的候選基因。

圖4　轉(zhuǎn)ghr-miR160基因擬南芥衰老延緩表型及相關(guān)指標測定Fig.4　PhenotypefordelayedleafsenescenceandresultsofrelateddetectioninArabidopsisoverexpressedghr-miR160

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