張希鶴 ，李巖 ，郁凱 ，霍鈺陽(yáng) ，王友華 ，2，陳兵林 ，2*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與生產(chǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095；2.江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210095）

黃萎病是1種植物土傳維管束病害，具有分布廣、危害重、存活時(shí)間長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)乃至世界棉花生產(chǎn)上最主要的病害之一。近年來(lái)黃萎病有逐年擴(kuò)增趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了棉花的產(chǎn)量、品質(zhì)，對(duì)我國(guó)棉花生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，到目前為止尚無(wú)根治黃萎病的方法[1]。葉片是黃萎病癥狀的主要表現(xiàn)部位，快速準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)黃萎病脅迫下棉花葉片光合特性的變化，對(duì)棉花黃萎病抗性鑒定和防治工作具有重要的指導(dǎo)意義。

目前棉花黃萎病的研究已經(jīng)深入到分子和基因水平，并已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步[2]，但對(duì)光合熒光等基礎(chǔ)生理的研究卻相對(duì)不足且不成體系。黃萎病菌侵染棉株易造成導(dǎo)管堵塞[3]，病菌分泌的毒素造成葉綠素合成受阻、光合系統(tǒng)受損、細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致棉花葉面積減小，葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率降低[4-5]。隨著黃萎病逐漸加重，葉綠素?zé)晒鈪?shù)初始熒光（F0）逐漸增大，可變熒光（Fv）、最大熒光（Fm）、潛在最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）等逐漸降低，光合電子傳遞受到抑制，光合結(jié)構(gòu)受損[6]。葉綠素?zé)晒馀c光合作用過程緊密相關(guān)，任何逆境對(duì)光合作用的影響都可以通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化反映出來(lái)[7]。系統(tǒng)分析光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，有利于準(zhǔn)確認(rèn)知黃萎病對(duì)棉花光合作用的抑制機(jī)理。

目前多是基于大田環(huán)境研究黃萎病對(duì)棉花氣體交換參數(shù)[5]、葉綠素?zé)晒鈪?shù)[6]等單一指標(biāo)的影響，并沒有對(duì)光合熒光特性的綜合分析。對(duì)室內(nèi)苗期接種黃萎病菌條件下棉葉光合特性的研究與黃萎病脅迫對(duì)棉花光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線特征參數(shù)的影響更是鮮有報(bào)道。棉花苗期對(duì)黃萎病的抗性與大田鑒定結(jié)果具有較好的一致性[8-9]，在室內(nèi)接種黃萎病菌條件下研究黃萎病對(duì)棉花幼苗光合及熒光特性的影響，有助于揭示黃萎病影響棉花光合作用的生理機(jī)制。因此，本研究擬通過在室內(nèi)培養(yǎng)接種黃萎病菌后的棉花幼苗，測(cè)定棉葉光合和熒光參數(shù)的變化，結(jié)合葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，揭示黃萎病菌的致病機(jī)理和棉花的抗病機(jī)制，為棉花黃萎病抗性鑒定及制定黃萎病防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　棉花幼苗培養(yǎng)及黃萎病菌接種

1.1.1試驗(yàn)條件與材料。試驗(yàn)在人工氣候箱（RDN-1000D-4，寧波東南儀器有限公司生產(chǎn)）中進(jìn)行，全程相對(duì)濕度為80%。光照階段：溫度為25℃，光照時(shí)間為14 h，光照度為20 000 lx；黑暗階段：溫度為18℃，黑暗時(shí)間為10 h。供試品種為中植棉2號(hào)（ZZM-2，抗黃萎病品種）和冀棉11號(hào)（JM-11，感黃萎病品種）[10]。黃萎病菌菌種為大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌種V08DF1（由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供）。

1.1.2棉花幼苗培養(yǎng)。挑選無(wú)破損飽滿的光子，用70%（體積分?jǐn)?shù)）的酒精浸泡5 min，5%（體積分?jǐn)?shù)）的 H2O2浸泡2 h，無(wú)菌水沖洗 2～3次，再用無(wú)菌水浸種10 h后，平鋪在濕潤(rùn)的紗布上。棉種露白后，挑選根長(zhǎng)、種子大小基本一致的種子，播種在育苗杯 （長(zhǎng)×寬×高=8 cm×8 cm×15 cm）中，每杯4粒，每品種40杯。育苗基質(zhì)為已高壓滅菌的蛭石。子葉平展時(shí)定苗，每杯留1棵長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗。培養(yǎng)液為Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液，每周更換1次。

1.1.3黃萎病菌接種。棉苗2葉1心時(shí)，用醫(yī)用注射器吸取孢子濃度為1×107mL－1的黃萎病菌液20 mL注入棉苗根際蛭石基質(zhì)中，共接種20杯。以注射20 mL無(wú)菌水作為對(duì)照（20杯）。黃萎病菌孢子懸浮液的制備參考王省芬等[11]的方法。

1.2　測(cè)定內(nèi)容與方法

1.2.1光合特性的測(cè)定。接種后第2天，JM-11葉片開始出現(xiàn)病斑，第6天，發(fā)病率達(dá)60%。因此，接種后第6天，采用Li-6400XT型便攜式光合儀（美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)）測(cè)量棉花主莖倒1葉的光合特性，測(cè)定前先進(jìn)行20 min光適應(yīng)，每處理重復(fù)3次，取其平均值。

常規(guī)光合參數(shù)測(cè)定：使用LED 2×3型紅藍(lán)光源葉室，閉合式氣路，葉室溫度設(shè)為24℃，CO2濃度設(shè)為 400 μmol·mol－1， 光照度設(shè)為 1 400 μmol·m－2·s－1。

光響應(yīng)曲線參數(shù)測(cè)定：光照度梯度為1 600、1 400、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、75、50、25、0 μmol·m－2·s－1。

CO2響應(yīng)曲線參數(shù)測(cè)定：CO2濃度梯度為400、300、200、100、50、400、400、600、800、1 000、1 200、1 500 μmol·mol－1（參照 Li-6400XT 型便攜式光合儀的說明書設(shè)定）。

1.2.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。采用葉綠素?zé)晒饪焖俪上裣到y(tǒng)Chlorophyll fluorescence imager（英國(guó)Technologica公司生產(chǎn)）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

1.2.3其他測(cè)定內(nèi)容和方法。用3005型植物水勢(shì)壓力室 （美國(guó)Soilmoisture Equipment公司生產(chǎn)），于12:00―13:00測(cè)定棉花倒1葉的水勢(shì)。用LI-3100C型葉面積儀 （美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)）測(cè)定單株葉面積。參照李合生[12]的方法，測(cè)定棉花倒1葉的光合色素含量。

1.3　數(shù)據(jù)處理

氣孔限制值 （Ls）=1－Ci/C0. 其中：Ci為胞間CO2濃度，C0為空氣CO2濃度，閉合氣路下取C0=400 μmol·mol－1。

應(yīng)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 20.0軟件的最小顯著差數(shù)法 （Least significant difference，LSD法）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；光、CO2響應(yīng)曲線應(yīng)用Photosynthesis work bench程序進(jìn)行擬合[13]。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃萎病脅迫對(duì)棉花幼苗葉面積和葉水勢(shì)的影響

未接黃萎病菌的棉株（簡(jiǎn)稱“健株”）和接黃萎病菌的棉株（簡(jiǎn)稱“病株”），其葉面積在品種間差異較大 （圖1）。ZZM-2病株單株葉面積為161.1 cm2，比健株低0.93%，差異不顯著。JM-11病株單株葉面積為126.9 cm2，比健株低20.74%，差異顯著（P＜0.05），說明黃萎病對(duì)JM-11葉面積的影響較大。

黃萎病脅迫下，2個(gè)品種棉花葉水勢(shì)皆有所下降，降幅因品種抗病性而異（圖2）：ZZM-2抗病性較強(qiáng)，葉水勢(shì)下降26.84%，病株與健株間差異不顯著；而JM-11抗病性較差，葉水勢(shì)下降50.01%，病株與健株間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖1　黃萎病脅迫對(duì)不同抗性棉花品種單株葉面積的影響Fig.1　Effect of Verticillium wilt stress on leaf area per plant in two cotton cultivars with different resistance

圖2　黃萎病脅迫對(duì)不同抗性棉花品種正午葉水勢(shì)的影響Fig.2　Effect of Verticillium wilt stress on midday leaf water potential in two different cotton cultivars with different resistance

2.2　黃萎病脅迫對(duì)棉花光合特性的影響

2.2.1黃萎病脅迫對(duì)棉花光合色素含量的影響。黃萎病脅迫下，棉花光合色素含量皆有所下降（表1）。ZZM-2病株類胡蘿卜素含量下降9.09%，與健株差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；而葉綠素a、葉綠素b、光合色素總量，病株與健株差異均不顯著。感病品種JM-11病株葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、光合色素總量均顯著低于健株（P＜0.05）。

表1　黃萎病脅迫對(duì)不同抗性棉花品種光合色素含量的影響Table 1　Effect of Verticillium wilt stress on photosynthetic pigment contents in two cotton cultivars with different resistance　mg·g-1

2.2.2黃萎病脅迫對(duì)棉葉氣體交換參數(shù)的影響。黃萎病脅迫下，棉葉凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間 CO2濃度（Ci）均降低，氣孔限制值（Ls）均上升，下降或上升幅度因品種抗病性而異（表2）?？共∑贩NZZM-2病株的Pn下降8.55%，與健株差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；病株Gs、Ci分別下降 19.23%和 5.31%，Ls上升 12.9%，與健株差異皆未達(dá)顯著水平。對(duì)感病品種JM-11來(lái)說，黃萎 病 脅 迫 下 ，Pn、Gs、Ci下 降 53.65% 、62.50% 和17.88%，Ls上升28.21%，與健株差異皆達(dá)顯著水平（P＜0.05）。從各參數(shù)變化來(lái)看，JM-11的受脅迫程度要明顯大于ZZM-2。

表2　黃萎病脅迫對(duì)不同抗性棉花品種氣體交換參數(shù)的影響Table 2　Effect of Verticillium wilt stress on gas exchange parameters in two cotton cultivars with different resistance

2.2.3黃萎病脅迫對(duì)棉花光響應(yīng)曲線特征參數(shù)的影響。黃萎病脅迫下，ZZM-2的光飽和點(diǎn)（Light saturation point，LSP）、 表觀量子效率（Ap parent quantum yield，AQY）和最大凈光合速率（Pn(max)）均呈增加趨勢(shì)，光補(bǔ)償點(diǎn)（Light compensation point，LCP）和暗呼吸速率 （Dark respiration speed，RD）呈降低趨勢(shì)（表 3）。與健株相比，ZZM-2病株 LSP和Pn(max)分別增大 1.24%和9.44%，LCP降低49.95%，差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；病株 AQY 增加 20%，RD降低 41.84%，差異均不顯著。與健株相比，JM-11病株的LCP增加98.39%，RD增加 41.10%，LSP、AQY和Pn(max)分別降低41.13%、40.00%和55.75%，病株和健株間各參數(shù)差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。JM-11的健株光響應(yīng)曲線特征參數(shù)中僅AQY與ZZM-2相當(dāng)，其他參數(shù)均低于ZZM-2。

2.2.4黃萎病脅迫對(duì)棉花CO2響應(yīng)曲線特征參數(shù)的影響。黃萎病脅迫下，2個(gè)品種CO2響應(yīng)曲線的特征參數(shù)均下降，且病株與健株間差異皆達(dá)顯著水平（表4）。與健株相比，ZZM-2病株的光呼吸速率（RP）降低2.59%，Rubisco限制下的最大羧化速率（Vc（max））降低 13.40%，最大電子傳遞速率（Jmax）降低 6.28%，磷酸丙糖利用速率（VTPU）降低15.30%。ZZM-2病株各特征參數(shù)降幅均小于JM-11，而其健株的各特征參數(shù)均大于JM-11。

2.3　黃萎病脅迫對(duì)棉花葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

光合作用的強(qiáng)弱可以通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映出來(lái)。單葉葉綠素?zé)晒獬上駞?shù)表明，與健株相比，ZZM-2病株的潛在最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（YNPQ）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量 （YNO）分別增加1.25%、4.17%和10.53%，實(shí)際光化學(xué)效率（YⅡ）降低12.12%，但差異均不顯著，可變熒光（Fv）下降3.69%，差異達(dá)到顯著水平（表5）。JM-11病株與健株相比，除YNO增加120.83%外，其他參數(shù)均降低，且病株和健株間各參數(shù)的差異均達(dá)到顯著水平。ZZM-2各熒光參數(shù)的降幅均小于JM-11。

表3　黃萎病脅迫條件下凈光合速率對(duì)光合有效輻射響應(yīng)的特征參數(shù)Table 3　Characteristic parameters of response of net photosynthetic rate to photosynthetic active radiation under Verticillium wilt stress condition

表4　黃萎病脅迫條件下凈光合速率對(duì)胞間CO2濃度響應(yīng)的特征參數(shù)Table 4　Characteristic parameters of response of net photosynthetic rate to intercellular CO2concentration under Verticillium wilt stress condition　μmol·m－2·s－1

表5　黃萎病脅迫對(duì)不同抗性棉花品種葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 5　Effect of Verticillium wilt stress on chlorophyll fluorescence parameters in two cotton cultivars with different resistance

棉花葉綠素?zé)晒獬上癖砻?，ZZM-2健株葉片不同部位色差較大（圖3），說明葉片不同部位的Fv/Fm存在差異。ZZM-2的病株葉片與健株葉片相比，沒有明顯的病斑，F(xiàn)v/Fm變化不大。JM-11病葉具有明顯的病斑，病斑部位Fv/Fm顯著降低，而非病斑部位Fv/Fm并沒有降低。

圖3　棉花單葉葉綠素?zé)晒獬上馞v/Fm值圖像對(duì)比Fig.3　Picture contrast of value ofFv/Fmbetween healthy plants and diseased plants of cotton

3　討論

3.1　黃萎病脅迫對(duì)棉花葉水勢(shì)、葉面積及光合色素含量的影響

黃萎病易造成導(dǎo)管堵塞[3-4]，棉花葉水勢(shì)的降低可能與導(dǎo)管堵塞有關(guān)。黃萎病脅迫下，ZZM-2葉水勢(shì)下降26.84%，JM-11下降50.01%，ZZM-2的降幅小于JM-11，說明ZZM-2導(dǎo)管堵塞的程度小于JM-11。前人研究發(fā)現(xiàn)，棉花感黃萎病后葉面積減小，葉綠素含量下降，且葉綠素a的降幅大于葉綠素b的降幅[14]。本研究結(jié)果表明，黃萎病脅迫下，2個(gè)品種單株葉面積、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均下降，ZZM-2的降幅小于JM-11；感病品種JM-11葉綠素a的降幅為30.59%，大于葉綠素b的降幅23.53%，但抗病品種ZZM-2葉綠素a的降幅為1.12%，小于葉綠素b的降幅5.26%。這可能與測(cè)定時(shí)期和品種的抗病性不同有關(guān)。類胡蘿卜素的降幅要大于葉綠素a和葉綠素b。

3.2　黃萎病脅迫對(duì)棉花光合特性的影響

黃萎病脅迫導(dǎo)致棉花Pn、Gs、蒸騰速率同步降低[15]，本研究也有相似的結(jié)論。劉昭偉等[16]對(duì)棉花花鈴期土壤持續(xù)干旱研究表明，干旱前期Pn下降的主要原因是氣孔限制，隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，非氣孔限制逐漸成為主要原因。綜合許大全[17]和 Farquhart等[18]研究結(jié)果，判斷葉片Pn降低的主要原因是氣孔因素還是非氣孔因素的2個(gè)可靠依據(jù)是Ci和Ls的變化方向，Ci降低和Ls升高表明氣孔導(dǎo)度降低是主要原因；而Ci增高和Ls降低，則表明主要原因是非氣孔因素。本研究表明，2個(gè)品種在黃萎病脅迫下均表現(xiàn)為Ci降低和Ls升高，說明氣孔限制是導(dǎo)致2個(gè)品種Pn降低的主要原因。

前人研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，玉米Pn（max）、AQY、LSP顯著降低，LCP明顯升高[19]。本研究結(jié)果表明，黃萎病脅迫下，ZZM-2 的Pn（max）、AQY 和LSP分別增大 9.44%、20.00%和 1.24%，LCP和RD分別減小49.95%和41.84%，與前人的研究結(jié)果不同，說明ZZM-2通過增大利用光能的有效范圍和利用效率來(lái)減輕病原菌的危害，整體光合能力增強(qiáng)。 而 JM-11 的Pn（max）、AQY 和 LSP 分別下降55.75%、40.00%和41.13%，LCP和RD分別增加98.39%和41.10%，變化趨勢(shì)與前人的研究結(jié)果類似，說明JM-11利用的光能有效范圍縮小，光同化能力下降，整體光合能力減弱。植物光合作用的碳同化過程主要受Vc（max）、Jmax和VTPU的限制[20]。前人對(duì)黃瓜的研究表明，隨著基質(zhì)水勢(shì)的降低，Vc（max）、Jmax、VTPU逐漸降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃萎病脅迫下，ZZM-2 的Vc（max）、Jmax和VTPU分別降低13.44%、6.28%和 15.30%，JM-11分別降低19.96%、19.65%和16.54%，ZZM-2的降幅均小于JM-11，說明2個(gè)品種碳同化過程均受到黃萎病的限制，且ZZM-2受影響的程度小于JM-11。

3.3　黃萎病脅迫對(duì)棉花葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

葉綠素?zé)晒獗环Q為“光合作用的探針”，相較于反映光合作用“表觀性”的氣體交換參數(shù)更能反映其內(nèi)在機(jī)理[22]。陳兵等[6]研究發(fā)現(xiàn)，隨黃萎病級(jí)的增大，棉花病葉的Fv、Fv/Fm、YⅡ均降低。本研究結(jié)果表明，感病品種JM-11病株的Fv、Fv/Fm、YⅡ分別降低78.39%、8.75%和21.43%，與健株差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），變化趨勢(shì)與前人研究結(jié)果[6]一致，說明JM-11病株的光合器官受到了不可恢復(fù)的損傷[23-24]；而抗病品種ZZM-2病株除Fv下降顯著（P＜0.05）外，F(xiàn)v/Fm、YⅡ變化皆不顯著。

光抑制是植物光合作用中非氣孔限制的主要形式[25]。ZZM-2病株的YⅡ降低 12.12%，YNPQ和YNO分別增大4.17%和10.53%，與健株差異不顯著，JM-11病株的YⅡ和YNPQ降低 21.43%和48.99%，YNO增加120.83%，與健株差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說明2個(gè)品種病株P(guān)SⅡ吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的比例均減少，過剩激發(fā)能增加[26]。在黃萎病脅迫下，ZZM-2通過調(diào)節(jié)性和非調(diào)節(jié)性的光保護(hù)機(jī)制同時(shí)耗能，且各參數(shù)變化幅度較小，光合器官并沒有受損；JM-11通過調(diào)節(jié)性光保護(hù)機(jī)制耗能的比例降低，非調(diào)節(jié)性光保護(hù)機(jī)制耗能的比例大幅增加，光合器官受到了極嚴(yán)重的光損傷[16]。前人研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃萎病加重，棉花葉片的Fv/Fm等指標(biāo)逐漸降低，但由于使用的是普通光纖式葉綠素?zé)晒鈨x，無(wú)法區(qū)分病斑部位和非病斑部位的熒光參數(shù)[6]，因此很難表征整張葉片的熒光特性。本研究采用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對(duì)整張棉葉的熒光參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，葉片病斑部位的Fv/Fm值顯著降低，而非病斑部位的Fv/Fm值沒有降低甚至略有增大的趨勢(shì)，說明葉片非病斑部位的光合器官并沒有受損，甚至其光合能力有增強(qiáng)的趨勢(shì)，以降低病斑對(duì)光合的影響。因此，在黃萎病脅迫下，具有較強(qiáng)的光保護(hù)能力和較高的光能利用率，是抗病品種抗性較強(qiáng)的原因之一。

本研究?jī)H測(cè)定了棉花幼苗期光合和熒光特性的一些表觀參數(shù)，下一步將結(jié)合棉花碳氮代謝過程，探析黃萎病影響棉花光合和熒光特性的機(jī)理。

4　結(jié)論

黃萎病脅迫下，棉花葉水勢(shì)、單株葉面積、光合色素含量以及Pn等皆呈下降趨勢(shì)，ZZM-2的降幅均小于JM-11；ZZM-2葉綠素a的降幅小于葉綠素b，JM-11則相反；棉苗Pn降低，這主要是由氣孔限制引起；ZZM-2的光和CO2響應(yīng)曲線特征參數(shù)分別呈增強(qiáng)、減弱的趨勢(shì)，JM-11光和CO2響應(yīng)曲線特征參數(shù)均呈減弱趨勢(shì)；ZZM-2的Fv/Fm、YNPQ和YNO稍增大，YⅡ稍降低，但與健株差異皆不顯著，但Fv下降顯著，JM-11的Fv、Fv/Fm、YⅡ及YNPQ顯著下降，YNO大幅上升。因此，選擇光同化能力和碳同化能力較高、抗黃萎病性強(qiáng)的棉花品種，可以減小黃萎病對(duì)棉葉光合特性的影響，降低棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的損失。

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