吳濤，沈葉，王文杰，黃忠明，王時(shí)光，瞿軍

喉返神經(jīng)損傷是甲狀腺手術(shù)常見的并發(fā)癥之一，損傷方式有多種，如擠壓、結(jié)扎、燒灼及橫斷等[1]。損傷所致的聲帶麻痹可引起患者不同程度的聲音嘶啞、失音、嗆咳等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致窒息而危及生命[2]。對于喉返神經(jīng)損傷輕者可自行恢復(fù)，重者則永久麻痹[3]。目前即便在術(shù)中常規(guī)暴露喉返神經(jīng)，術(shù)后仍會(huì)出現(xiàn)一過性或永久性聲帶麻痹，概率分別為5%～6%及1%～2%[4]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類具有減少神經(jīng)變性、促進(jìn)神經(jīng)分化再生、刺激軸突生長、阻止疾病進(jìn)程的功能蛋白質(zhì)[5,6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可促進(jìn)軸突的生長及再生，在維持神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、定向遷移等發(fā)揮重要作用[7,8]。雖然已有部分研究[9-12]，但就喉返神經(jīng)損傷后的自我修復(fù)的研究仍較少。本研究擬通過建立大鼠單側(cè)喉返神經(jīng)擠壓傷模型，研究喉返神經(jīng)損傷術(shù)后其神經(jīng)和喉內(nèi)肌變化特征，明確神經(jīng)損傷自愈程度，為喉返神經(jīng)修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠30只（體質(zhì)量340～360 g，12周），隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各15只。動(dòng)物倫理遵守上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器 BF-1T160喉鏡（購于日本Olympus公司）；環(huán)氧樹脂包埋劑、甲苯胺藍(lán)（購于美國Sigma公司）；E600光學(xué)顯微鏡（購于日本Nikon公司）；BDNF抗體（購于美國Abcam公司）。

1.2 方法

戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg/kg）后大鼠取仰臥位，固定四肢。備皮，消毒，鋪巾，頸前正中垂直切口1 cm，分離頸前帶狀肌，在氣管食管溝處暴露右側(cè)喉返神經(jīng)，實(shí)驗(yàn)組在距右側(cè)喉返神經(jīng)入喉1 cm處擠壓長度為5 mm的喉返神經(jīng)，對照組僅暴露神經(jīng)。徹底止血，檢查器械及紗布無誤后逐層縫合頸部切口。通過纖維喉鏡檢查確定右側(cè)聲帶是否固定，若未固定，則將該動(dòng)物剔除。術(shù)后所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 術(shù)后一般情況觀察 術(shù)后觀察大鼠有無發(fā)熱、切口感染、死亡等情況發(fā)生。

1.3.2 發(fā)聲功能評估 術(shù)后1 d、4周、8周、12周時(shí)，在6、12、18點(diǎn)三個(gè)時(shí)刻，針刺2組大鼠右后肢刺激其發(fā)聲，使用錄音筆記錄30 s的發(fā)聲音頻。由于GRBAS標(biāo)準(zhǔn)對聲樣分級中總嘶啞度（grade，G）的評定結(jié)果最為穩(wěn)定且可靠[13]，所以選擇兩位研究者獨(dú)立評估同一聲樣的G值，若兩者意見不符，則取第三人所評估G值作為最后結(jié)果。G值分為四級：正常為0級，輕度為1級，中度為2級，重度為3級。

1.3.3 杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)評估 術(shù)后4周、8周、12周時(shí)，通過喉鏡觀察2組大鼠杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)情況（圖1A）。截取杓狀軟骨最大開放角度的圖片，通過PS CC軟件分析測量兩側(cè)杓狀軟骨間夾角度數(shù)。

1.3.4 喉返神經(jīng)擠壓處軸突數(shù)目計(jì)數(shù) 術(shù)后4周、8周、12周時(shí)，隨機(jī)選取2組各5只大鼠，過量戊巴比妥鈉麻醉處死（120 mg/kg），距離右側(cè)喉返神經(jīng)入喉處1 cm，近心端切取5 mm神經(jīng)標(biāo)本。神經(jīng)標(biāo)本放置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定3 d，1%四氧化鋨固定24 h，通過梯度丙酮（30%、60%、90%、100%、100%、100%）脫水各20 min，環(huán)氧樹脂812包埋，待樹脂硬化后使用超薄切片機(jī)切取厚度為1 μm切片，1%甲苯胺藍(lán)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照（圖2A），使用PS CC軟件計(jì)數(shù)。

1.3.5 甲杓肌中BDNF表達(dá)水平評估 術(shù)后4周、8周、12周時(shí)，取下2組大鼠全喉，在解剖顯微鏡下解剖甲杓肌。經(jīng)過組織固定、脫水、石蠟包埋后，切取厚度為4 μm的組織切片進(jìn)行免疫組化染色。滴加BDNF抗體（1∶75）過夜孵育后，加入二抗經(jīng)DAB顯色后拍照（圖3A），通過Image Pro Plus 6.0分析BDNF表達(dá)情況，計(jì)算相對光密度，相對光密度=實(shí)驗(yàn)組IOD/對照組IOD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

30只大鼠術(shù)后全部存活，無發(fā)熱、切口感染等情況發(fā)生。

2.2 發(fā)聲功能

對照組大鼠聲音清脆、尖銳，G0。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d發(fā)聲嘶啞、無力，G3；術(shù)后4周聲音嘶啞較前有好轉(zhuǎn)，G2；術(shù)后8周有較大改善，聲音略低沉，G1；術(shù)后12周聲音比較尖銳，主觀評估與對照組無差異，G0。

2.3 杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)角度

對照組兩側(cè)杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)對稱，最大角度可達(dá)（42.11±10.91）°。實(shí)驗(yàn)組喉返神經(jīng)擠壓傷后即刻出現(xiàn)聲帶固定，術(shù)后4周時(shí)右側(cè)杓狀軟骨癱瘓，左右不對稱，最大角度為（23.11±4.99）°；術(shù)后8周時(shí)杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)有改善，最大角度為（29.57±8.12）°；術(shù)后12周時(shí)杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)恢復(fù)，開放最大角度為（37.98±3.56）°，此時(shí)與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1B）。

2.4 軸突數(shù)目分析

對照組的喉返神經(jīng)軸突數(shù)目為（225.59±7.51）；實(shí)驗(yàn)組的喉返神經(jīng)損傷后軸突數(shù)目有所減少，術(shù)后4周為（212.33±8.91），術(shù)后8周為（216.25±7.49），術(shù)后12周為（220.81±12.58）（圖2B）。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后的軸突數(shù)目先減少，隨時(shí)間延長有所增長，直到術(shù)后12周與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 甲杓肌中BDNF表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組的BDNF在甲杓肌中的表達(dá)在喉返神經(jīng)損傷后下降，隨時(shí)間延長逐漸上升，術(shù)后4周相對光密度為（0.45±0.15）；術(shù)后8周時(shí)為（0.71±0.19）；術(shù)后12周時(shí)為（1.20±0.11），與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

注：A為喉返神經(jīng)損傷后杓狀軟骨運(yùn)動(dòng)情況，可見右側(cè)有癱瘓；B為杓狀軟骨開放最大角度分析，隨術(shù)后時(shí)間延長，最大角度逐漸增大（n=15）。與對照組比較，①P＜0.05

3 討論

喉返神經(jīng)損傷修復(fù)的研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。臨床上由于各種原因而導(dǎo)致喉返神經(jīng)麻痹的病例很多，可引起患者發(fā)音和呼吸功能障礙[4]；如何使去神經(jīng)的喉內(nèi)肌恢復(fù)神經(jīng)化，是治療關(guān)鍵。目前，喉返神經(jīng)損傷修復(fù)的方法有甲狀軟骨成形術(shù)、杓狀軟骨內(nèi)手術(shù)、喉返神經(jīng)端端縫合術(shù)及神經(jīng)肌蒂移植術(shù)等，雖然有一定的臨床意義，但術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)效果仍不佳[14]。明確喉返神經(jīng)擠壓損傷后其病理生理變化情況對指導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)有重要意義。

喉內(nèi)肌由喉返神經(jīng)及喉上神經(jīng)外支支配，喉返神經(jīng)支配除環(huán)甲肌之外的所有喉內(nèi)肌[15]。甲杓肌作為喉內(nèi)肌，在發(fā)音和呼吸中發(fā)揮重要作用，且它是喉返神經(jīng)損傷后最容易受到影響的肌肉，所以本研究選取甲杓肌為研究對象[16]，觀察神經(jīng)受損后甲杓肌中BDNF的表達(dá)變化。當(dāng)喉返神經(jīng)損傷后，由于甲杓肌失去支配該肌的神經(jīng)的營養(yǎng)作用，其結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生很大的變化。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組喉返神經(jīng)擠壓傷后，即刻出現(xiàn)聲帶固定，在觀察時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，聲帶運(yùn)動(dòng)、發(fā)聲、軸突數(shù)目均逐漸改善，直到術(shù)后12周恢復(fù)正常。結(jié)合BDNF表達(dá)量的分析，筆者推斷，由于擠壓傷較橫斷傷而言，損傷較輕，在術(shù)后隨著缺少的神經(jīng)營養(yǎng)因子的不斷補(bǔ)充等自發(fā)性修復(fù)的發(fā)生，使得肌肉得到相應(yīng)的神經(jīng)化，進(jìn)而喉功能得到改善。

擠壓傷屬于神經(jīng)損傷Sunderland分級中的2級，是一種主要造成軸突損傷的形式[14]。眾所周知，神經(jīng)損傷形式及神經(jīng)軸突的數(shù)目與神經(jīng)損傷后修復(fù)密切相關(guān)[17]。喉返神經(jīng)擠壓傷后，由于局部缺血、電解質(zhì)濃度變化等因素，導(dǎo)致髓鞘破壞并使軸突的再生受到抑制[14]。雖然擠壓傷不是神經(jīng)最嚴(yán)重的損傷形式，但可以模擬手術(shù)中所造成的軸索斷裂損傷[18]。研究發(fā)現(xiàn)受到擠壓的喉返神經(jīng)的神經(jīng)再生隨時(shí)間延長而逐漸改善，直到術(shù)后12周神經(jīng)軸突數(shù)目達(dá)到對照組水平，表明神經(jīng)擠壓傷后存在一定的自我修復(fù)功能。

肌肉由神經(jīng)支配，肌纖維的成熟、分化及維持成熟肌纖維正常的結(jié)構(gòu)和功能均依賴于神經(jīng)所分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子，肌纖維去神經(jīng)支配后由于神經(jīng)營養(yǎng)因子丟失導(dǎo)致肌肉發(fā)生一系列變化，如新陳代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化等[9]。BDNF可促進(jìn)軸突生長、神經(jīng)存活及塑形[19]，本研究發(fā)現(xiàn)喉返神經(jīng)擠壓傷術(shù)后，BDNF在4周時(shí)有明顯降低，之后呈上升趨勢，其變化特點(diǎn)與神經(jīng)再生的恢復(fù)類似，表明BDNF表達(dá)水平與神經(jīng)修復(fù)密切相關(guān)，應(yīng)用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子有可能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)進(jìn)程。

本研究存在一定局限性，如動(dòng)物樣本量小、術(shù)后觀測時(shí)間較短，只測定一種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)水平，后續(xù)應(yīng)增加神經(jīng)因子種類，研究它們在神經(jīng)再生過程中的變化趨勢，并進(jìn)一步量化分析。本研究表明，大鼠單側(cè)喉返神經(jīng)擠壓傷后有一定自我恢復(fù)能力，其神經(jīng)所支配的生理功能得到改善，BDNF表達(dá)水平與神經(jīng)修復(fù)過程息息相關(guān)。

[1]陳世彩,鄭宏良,周水淼,等.甲狀腺手術(shù)喉返神經(jīng)損傷規(guī)律及治療的探討[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2004,39:464-468.

[2]李孟,鄭宏良.甲狀腺手術(shù)單側(cè)喉返神經(jīng)損傷手術(shù)探查與修復(fù)[J].中國實(shí)用外科雜志,2012,32:364-367.

[3]申曦,李小毅,劉躍武,等.非返性喉返神經(jīng)的解剖特點(diǎn)及術(shù)中損傷的預(yù)防[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2013,20:71-76.

[4]張品一,張濱,劉垚,等.甲狀腺手術(shù)中喉返神經(jīng)變異的臨床研究[J].中華普通外科雜志,2013,28:431-435.

[5]王保鑫,董頻.神經(jīng)營養(yǎng)因子對喉返神經(jīng)損傷再生的研究進(jìn)展[J].中國眼耳鼻喉科雜志,2014,14:52-55.

[6]李孟,陳世彩,陳東輝,等.肝細(xì)胞生長因子對喉返神經(jīng)損傷后再生的作用[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志,2012,20:467-471.

圖2 喉返神經(jīng)軸突數(shù)目分析

注：A為神經(jīng)斷端（甲苯胺藍(lán)染色，×100）。B為神經(jīng)斷端軸突數(shù)目分析圖，喉返神經(jīng)損傷術(shù)后其軸突數(shù)目先減少，隨時(shí)間延長有所增長（n=15）。與對照組比較，①P＜0.05

[7]曾維軍,周文勝,王佳.神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子在神經(jīng)干細(xì)胞中的研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志,2015,35:484-489.

[8]趙慧新,趙鋼勇,張平.移植腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對AD大鼠的影響[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2014,9:195-198.

[9]何雙八,孫敬武,孫東東.單側(cè)喉返神經(jīng)切斷后甲杓肌結(jié)構(gòu)與酶學(xué)變化的實(shí)驗(yàn)性研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,40:231-233.

[10]徐文,趙功偉,胡慧英,等.喉返神經(jīng)損傷后喉肌病理生理研究[J].臨床耳鼻喉頭頸外科雜志,2009,23:403-406.

[11]Vega-Cordova X,Cosenza NM,Helfert RH,et al.Neurotrophin expression of laryngeal muscles in response to recurrent laryngeal nerve transection[J].Laryngoscope,2010,120:1591-1596.

[12]Tessema B,Roark RM,Pitman MJ,et al.Observations of recurrent laryngeal nerve injury and recovery using a rat model[J].Laryngoscope,2009,119:1644-1651.

[13]施劍斌,鄭宏良,陳世彩,等.改良杓狀軟骨內(nèi)收術(shù)治療單側(cè)聲帶麻痹[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志,2010,18:29-32.

[14]Araki K,Shiotani A,Watabe K,et al.Adenoviral GDNF gene transfer enhances neurofunctional recovery after recurrent laryngeal nerve injury[J].Gene Ther,2006,13:296-303.

[15]Sanuki T,Yumoto E,Komori M,et al.Expression of fibroblast growth factor-2 in the nucleus ambiguus following recurrent laryngeal nerve injury in the rat[J].Laryngoscope,2000,110:2128-2134.

[16]Iizuka T.[Experimental studies on the nerve interception and atrophy of the intrinsic muscles of the larynx][J].Nihon Jibiinkoka Gakkai Kaiho,1966,69:176-195.

[17]Toya Y,Kumai Y,Minoda R,et al.Modulation of nerve fibers in the rat thyroarytenoid muscle following recurrent laryngeal nerve injury[J].Acta Otolaryngol,2012,132:305-313.

[18]Fung K,Hogikyan ND,Heavner SB,et al.Development and characterisation of an experimental recurrent laryngeal nerve injury model for the study of viral gene therapy[J].J Laryngol Otol,2008,122:500-505.

[19]Han Q,Jin W,Xiao Z,et al.The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody[J].Biomaterials,2010,31:9212-9220.