趙海霞 任麗伊 左 璇 李云竹 李淑蓉 蘇炳銀△

(成都醫(yī)學(xué)院， 1 發(fā)育與再生四川省重點實驗室，>2 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室， 3 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室， 成都 610500)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)是一群具有自我增殖和分化潛能的細(xì)胞，可修復(fù)和替代神經(jīng)退行性疾病中受損的神經(jīng)細(xì)胞，重建細(xì)胞環(huán)路和功能，隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的途徑[1-2]。 NSCs[1]經(jīng)各級神經(jīng)前體細(xì)胞，可分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[3]。因此，調(diào)控NSCs定向分化是目前應(yīng)用于治療的關(guān)鍵。目前，用于NSCs分化模型建立的主要誘導(dǎo)方式是血清和全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, RA)誘導(dǎo)，本研究擬利用血清和RA分別誘導(dǎo)從胚胎小鼠分離并培養(yǎng)的NSCs，比較兩者對NSCs的分化以及神經(jīng)元突起生長的作用差異，為NSCs分化機制研究的模型選擇提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57雌性和雄性小鼠(2～3個月年齡)購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑

小鼠單克隆抗體nestin(ab6142)和小鼠單克隆抗體Map2(ab11267)、兔多克隆抗體GFAP(ab7260)購自Abcam公司；594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG熒光二抗和488標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光二抗488購自Invitrogene公司；DMEM/F12(1∶1)基本培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、Accutase酶、B27、GlutaMax、Heparin購自Gibco公司；堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生長因子(epithelial growth factor, EGF)購自PeproTech公司； RA、多聚賴氨酸(poly-D-lysine, PDL)購自Sigma公司；DAPI封片劑購自中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 NSCs分離和培養(yǎng)

將2～3月齡發(fā)情期的雌性小鼠與雄性小鼠交配過夜，次日早晨檢栓陽性的小鼠為妊娠期0.5 d。收集胚齡E12.5 d的胎鼠，分離腦皮質(zhì)組織，并用Accutase酶在37℃處理10 min，同時用槍輕輕吹打，使組織解離成單細(xì)胞，然后通過40 μm細(xì)胞篩濾過。細(xì)胞懸液以 1 000 r/min離心5 min，去上清。加入NSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，以2105 cells/ml的密度接種到培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d半量換液[3]，6～7 d后收集增殖形成的神經(jīng)球，消化成單細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。NSCs培養(yǎng)基成分：DMEM/F12、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液、1% GlutaMax、2 μg/ml Heparin、2% B27、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF。

1.4 NSCs誘導(dǎo)分化

收集傳代培養(yǎng)2～3代的神經(jīng)球，消化成單細(xì)胞，以2×105cells/ml的密度接種到已用PDL包被的24孔培養(yǎng)板中，并加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)3 d或者7 d。每3 d換液1次。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：DMEM/F12、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液、1% GlutaMax、2 μg/ml Heparin、2% B27、2%血清或者1 μmol/L RA。

1.5 免疫熒光染色

將24孔培養(yǎng)板中的分化培養(yǎng)基吸出，加入預(yù)冷的PBS輕輕清洗1次，然后用4%多聚甲醛于室溫固定30 min。PBS洗滌3次，封閉液(含10%羊血清和0.3% Triton X-100)室溫封閉1 h，一抗(1∶200)4℃孵育過夜。二抗(1∶400)室溫孵育1 h。加入DAPI封片劑，熒光顯微鏡觀察并拍照。

對于神經(jīng)球的免疫熒光染色，需提前將培養(yǎng)6～7 d的神經(jīng)球接種到PDL包被的培養(yǎng)板中，貼壁2～3 h。方法同前，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行抗體孵育、熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 圖像定量分析

使用Adobe Photoshop圖像處理軟件計數(shù)免疫熒光染色陽性的細(xì)胞數(shù)目和DAPI染色的總細(xì)胞數(shù)目，分析免疫熒光染色陽性的細(xì)胞數(shù)目占DAPI染色的總細(xì)胞數(shù)目的百分比。其中在每個時間點，每個誘導(dǎo)組含5個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)在熒光顯微鏡下拍攝3個區(qū)域用于計數(shù)。使用Image-Pro Plus(IPP)圖像處理分析軟件測量Map2陽性的神經(jīng)元突起的數(shù)目，以及突起的長度。其中在每個時間點，每個誘導(dǎo)組含5個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)分別統(tǒng)計60個Map2陽性的神經(jīng)元的突起數(shù)目，并測量60個突起的長度。

1, 7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NSCs培養(yǎng)及鑒定

E12.5 d的胎鼠腦皮質(zhì)組織被解離成單細(xì)胞后，在NSCs培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2 d后，原代培養(yǎng)的NSCs增殖，可見4～6個細(xì)胞聚集在一起(圖1A，見封底)；4 d后，NSCs增殖形成約50 μm直徑的神經(jīng)球(圖1B，見封底)；6 d后，NSCs增殖形成約100 μm直徑的神經(jīng)球(圖1C，見封底)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)球收集后，重新消化成單細(xì)胞傳代培養(yǎng)，6～7 d后NSCs再次增殖形成神經(jīng)球。將傳代3次后形成的神經(jīng)球，用免疫熒光檢測NSCs的標(biāo)記分子nestin的表達(dá)。檢測顯示神經(jīng)球中的細(xì)胞為nestin陽性的NSCs(圖1D-F，見封底)。

2.2 血清和RA誘導(dǎo)對神經(jīng)元分化的影響

神經(jīng)球傳代3次后，消化成單細(xì)胞，接種于PDL包被的24孔培養(yǎng)板中，分別用血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基和RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs 3 d或7 d。誘導(dǎo)3 d后，NSCs可分化為神經(jīng)元，并能被神經(jīng)元標(biāo)記分子Map2所標(biāo)記(圖2，見封底)。統(tǒng)計分析顯示，誘導(dǎo)3 d后，RA誘導(dǎo)組中Map2陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例顯著高于血清誘導(dǎo)組(P<0.01)(圖4A)。誘導(dǎo)7 d后，免疫熒光檢測顯示仍有Map2陽性的神經(jīng)元(圖3)，RA誘導(dǎo)組中的Map2陽性的細(xì)胞占總細(xì)胞的比例仍顯著高于血清誘導(dǎo)組(P<0.01)(圖4A)。但是隨著誘導(dǎo)時間的延長，Map2陽性的神經(jīng)元所占比例在血清誘導(dǎo)組中顯著降低(P<0.05)，在RA誘導(dǎo)組中沒有明顯變化(圖4A)。

2.3 血清和RA誘導(dǎo)對星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響

血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基和RA誘導(dǎo)培養(yǎng)基不僅能誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元，也能分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，并被星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記分子GFAP所標(biāo)記(圖2-3，見封底)。免疫熒光檢測顯示誘導(dǎo)3 d或7 d后，血清誘導(dǎo)組中GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞占總細(xì)胞的比例都顯著高于RA誘導(dǎo)組(P<0.01和P<0.01)(圖4B)。與誘導(dǎo)3 d相比，血清誘導(dǎo)組和RA誘導(dǎo)組中的GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞所占的比例在誘導(dǎo)7 d后，都進(jìn)一步顯著升高(P<0.01)(圖4B)。

進(jìn)一步觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)顯示，血清誘導(dǎo)組和RA誘導(dǎo)組中的膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)差異較大。誘導(dǎo)分化3 d，血清誘導(dǎo)組的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體較大，突起較短，呈原漿型，而RA誘導(dǎo)組中膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，呈卵圓型，突起較長，但突起數(shù)目較少，呈放射性膠質(zhì)細(xì)胞樣(radial glia-like)形態(tài)(圖2，見封底)；誘導(dǎo)分化7 d，血清誘導(dǎo)組的星形膠質(zhì)細(xì)胞仍呈原漿型(protoplasmic-like)，而RA誘導(dǎo)組中的膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起明顯增多，較細(xì)，并且突起末端較膨大(圖3，見封底)。

圖4 血清和RA誘導(dǎo)對NSCs分化的影響Fig 4 The effects of serum and RA treatments on the differentiation of neural stem cells in vitro

2.4 血清和RA誘導(dǎo)對神經(jīng)元突起生長的影響

為檢測血清和RA誘導(dǎo)對神經(jīng)元突起生長的影響，本研究首先統(tǒng)計分析了誘導(dǎo)分化3 d及7 d后神經(jīng)元突起的長度。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化3 d后，RA誘導(dǎo)組中的神經(jīng)元突起長度與血清誘導(dǎo)組中的沒有差異，但是誘導(dǎo)7 d后，RA誘導(dǎo)組的突起長度明顯長于血清誘導(dǎo)組(P<0.01)(圖5A)。不僅如此，與誘導(dǎo)分化3 d相比，血清誘導(dǎo)組中神經(jīng)元突起的長度在誘導(dǎo)7 d后沒有明顯變化，但是RA誘導(dǎo)組中的神經(jīng)元突起長度在誘導(dǎo) 7 d 后顯著增長(P<0.01)(圖5A)。

進(jìn)一步分析誘導(dǎo)分化神經(jīng)元突起的數(shù)目顯示，誘導(dǎo)分化3 d后，RA誘導(dǎo)組的神經(jīng)元突起數(shù)目比血清誘導(dǎo)組少(P<0.01)，但是誘導(dǎo)分化7 d后，RA誘導(dǎo)組的突起數(shù)目明顯比血清誘導(dǎo)組多(P<0.01)(圖5B)。另外，結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時間的延長，RA誘導(dǎo)組和血清誘導(dǎo)組中的突起數(shù)目都明顯增加(P<0.05和P<0.01)(圖5B)。

圖5 血清和RA誘導(dǎo)對神經(jīng)元突起生長的影響Fig 5 The effects of serum and RA treatments on the neurite outgrowth in vitro

3 討論

NSCs由于其具有自我增殖和多向分化的能力，自Reynolds等[4]于1992年從成年小鼠紋狀體分離后，便成為理論研究和臨床應(yīng)用的熱點之一。NSCs的分化受到許多基因的有序調(diào)控，但目前這些基因的作用機制并未完全闡明。因此，許多研究利用RA誘導(dǎo)或血清誘導(dǎo)NSCs分化模型探討NSCs的分化機制，為相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

血清含有多種營養(yǎng)成分，包括許多生長因子、激素等， 常被用作誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化。NSCs在血清培養(yǎng)基中，能先后分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[5]。已有研究表明血清濃度對NSCs分化為神經(jīng)元或者膠質(zhì)細(xì)胞有影響，低濃度血清有利于NSCs向神經(jīng)元方向的分化[6-7]。RA作為維生素A的代謝中間產(chǎn)物，在腦發(fā)育及神經(jīng)再生中具有重要作用，其可維持HRas蛋白的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向的分化[8-9]。盡管如此，而高濃度的RA也會導(dǎo)致腦發(fā)育異常，胚胎畸形，主要認(rèn)為是RA異常激活了胚胎發(fā)育中相關(guān)基因的表達(dá)及功能。在體外培養(yǎng)中，研究顯示RA可通過調(diào)節(jié)RARs以及PPARβ/δ(過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，常作為誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)NSCs、胚胎干細(xì)胞等分化為神經(jīng)元，并且其在誘導(dǎo)分化模型中常用的濃度為1 μmol/L[10]。因此，本研究進(jìn)一步比較了低濃度的血清(2%)和 1 μmol/L 濃度的RA對NSCs的分化以及對神經(jīng)元突起生長的影響。

本研究表明RA比血清更易誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元。無論是短期誘導(dǎo)3 d，或者長期誘導(dǎo)7 d，RA誘導(dǎo)組中的神經(jīng)元的比例明顯比血清誘導(dǎo)組更高。不僅如此，在誘導(dǎo)NSCs分化過程中，RA誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元的持續(xù)周期更長。隨著誘導(dǎo)時間從3 d延長至7 d，血清誘導(dǎo)組中的神經(jīng)元比例顯著降低，而RA誘導(dǎo)組中神經(jīng)元比例變化不明顯。在神經(jīng)修復(fù)中，不僅需要提高損傷處的神經(jīng)元的數(shù)目，也需要增強神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)連接功能，因此，神經(jīng)元的突起的生長是神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵之一[1]。Dmetrichuk等[11]的研究表明RA可誘導(dǎo)非脊椎動物靜水椎實螺的神經(jīng)元突起的生長。Chu等[12]的研究進(jìn)一步證實并且RA能促進(jìn)脊椎動物大鼠的NSCs衍生而來的神經(jīng)元突起的生長。在比較血清和RA對誘導(dǎo)生成的神經(jīng)元的突起生長的影響研究中顯示，RA更利于促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長。短期誘導(dǎo)形成的神經(jīng)元突起的長度在兩者之間沒有差異，但是在長期誘導(dǎo)后，RA顯著提高了突起的長度以及神經(jīng)元突起的數(shù)目。另外，在短期誘導(dǎo)中顯示，RA誘導(dǎo)的突起的數(shù)目比血清誘導(dǎo)的少，盡管如此，誘導(dǎo)時間延長后，RA誘導(dǎo)的突起數(shù)目明顯增加，推測可能是RA比血清促進(jìn)神經(jīng)元成熟的時期稍晚。

已有報道證實RA不僅能誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元，也能誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生[13]。本研究顯示血清和RA誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的分化具有時間依賴性，隨著時間的延長，兩者誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的比例都不斷增加。盡管如此，血清更易誘導(dǎo)NSCs分化為膠質(zhì)細(xì)胞。相較于RA誘導(dǎo)組，血清誘導(dǎo)組中的膠質(zhì)細(xì)胞的比例更高。 另外，本研究結(jié)果顯示血清和RA誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不一致。其中，在誘導(dǎo)3 d后，RA誘導(dǎo)形成的膠質(zhì)細(xì)胞具有放射性膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，而血清中的膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈原漿型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。已有研究表明放射性膠質(zhì)細(xì)胞具有分化神經(jīng)元的潛能[14-15]。因此，推測RA在早期誘導(dǎo)形成的膠質(zhì)細(xì)胞并未完全分化成成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞可進(jìn)一步分化為部分神經(jīng)元，利于維持在誘導(dǎo)后期的較高水平的神經(jīng)元的比例。