胡東昊 王喬新 劉鳳云 謝金枝 李偉宏

(1 焦作職工醫(yī)學院， 焦作 454150； 2 鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校， 鄭州 450064)

近年來，隨著各種惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率的增高[1]，腫瘤的免疫治療得到更廣泛的關(guān)注，研究的熱點也更傾向于開發(fā)新型腫瘤疫苗[2]。多肽疫苗作為一個很有潛力的腫瘤疫苗已經(jīng)應用于各種腫瘤的免疫治療中[3]。多肽疫苗在原有誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)能力的基礎(chǔ)上也有新的進展，多表現(xiàn)在增強多肽疫苗抗腫瘤效應的策略方面。如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯(lián)用，增加多肽的長度，克服HLA分子限制性等[4]。一些臨床實驗表明，與最小CTL表位單肽疫苗相比，用長肽進行疫苗接種能夠改善特異性CTL應答[5]。CTNNA2屬于癌睪抗原(cancer testis, CT)抗原，是與經(jīng)典鈣黏蛋白相關(guān)的細胞骨架組分連環(huán)蛋白家族的成員。其功能與細胞黏附有關(guān)，同時它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡化程度相關(guān)[6]。CTNNA2在正常組織中僅僅表達于睪丸和腦組織，而在多發(fā)性骨髓瘤細胞、黑色素瘤細胞和卵巢癌細胞中都有顯著的表達[7]。本研究選擇CTNNA2進行預測并設計長肽進行免疫學活性實驗，旨在為腫瘤多肽疫苗候選效果更好的長肽。

1 材料和方法

1.1 材料

MCF-7由實驗室常規(guī)保存，采用37℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。T2A2細胞:轉(zhuǎn)染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細胞系，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基在37℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A2+健康供者捐贈。HLA-A2+外周血健康供者來自尋找的健康供者。

1.2 設計長肽疫苗及HLA-A2限制性CTL表位肽的合成

首先對癌睪抗原CTNNA2進行HLA-A2限制性CTL表位肽的預測，使用生物信息學預測軟件NetCTL 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)[8]、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHC Server.dll/Epitope Prediction.htm)[9]和BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)[10]軟件對CTNNA2氨基酸序列的預測打分，CTL表位限制性MHC類型HLA-A*02。預測抗原肽長度(nonamers 9aa)。目的抗原 CTNNA2 的氨基酸序列參照NCBI(NP_001269526.1)所提供的序列。根據(jù)集中的HLA-A2限制性CTL表位設計CTNNA2抗原來源的長肽，共獲得3條長肽，分別為CTNNA2 P129-156、P778-800、P857-880。候選肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)反相高效液相色譜法分析純化后，其純度大于95%，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法鑒定相對分子質(zhì)量符合理論值。

1.3 PBMCs分離

準備50 ml離心管，預先加肝素鈉，預防血凝。抽取外周血20 ml或40 ml，加入等體積的PBS混勻；將淋巴細胞分離液4 ml 加入到15 ml 離心管中，緩慢注入PBS與血液的混合液8 ml；常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，2 000 r/min離心20 min后，用彎管將上層血清抽掉，再輕輕抽取白膜層；按PBS：白膜層細胞>5∶1的比例，洗滌白膜層，2 000 r/min離心15 min，收集白膜層細胞；用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。

1.4 樹突狀細胞的體外誘導

按上述方法分離得到PBMCs，10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)2×106/ml，每孔2 ml 分至6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；將未黏附的細胞洗脫，抽取液體及未貼壁的細胞，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，在6孔板里加入溫熱的IMDM培養(yǎng)基2 ml，加入IMDM培養(yǎng)基2 ml，并補加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)(100 ng/ml)、白細胞介素4(IL-4)(50 ng/ml)；于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；2 d半量換液1次，并補加GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)；培養(yǎng)至第5天加入脂多糖(LPS)(100 ng/ml)，誘導樹突狀細胞(DC)成熟；48 h后收集細胞[11]。

1.5 DC荷肽實驗

收集成熟的DC，無血清IMDM培養(yǎng)基充分洗滌，重懸計數(shù)1×106/ml；加入長肽20 μg/mL，培養(yǎng)4h；收集細胞，用無血清IMDM培養(yǎng)基洗滌1次；重懸計數(shù)，加入50～100 μg的絲裂霉素C，加入20 μg/ml的長肽，培養(yǎng)1 h；10%已滅活的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)2×105/ml；取PBMCs，重懸計數(shù)2×106/ml，荷肽的DC作為刺激細胞，兩者各取0.5 ml加入24孔板；隔日添加rIL-2(50 U/ml)，每3 d半量換液，并補加rIL-2；1周后收集細胞，以10∶1的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養(yǎng)，進行第2輪刺激；第3次刺激后的第3天收集細胞，用于后續(xù)活性實驗[12]。

1.6 IFN-γ分泌水平的檢測

取出酶聯(lián)免疫斑點實驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT，購自達科為生物技術(shù)有限公司)板條，加200 μl無血清的IMDM培養(yǎng)基進行封閉，靜置10 min；將前期誘導的CTL作為效應細胞，調(diào)整細胞濃度為2×106/ml，每孔加50 μl，荷肽的DC作為刺激細胞，補加40 μl的無血清IMDM培養(yǎng)基，設立對照孔和實驗孔；37℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μl無菌的去離子水，4℃裂解細胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μl 1×washing buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μl生物素標記的抗體，37℃孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μl 1×washing buffer進行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μl酶聯(lián)親和素，37℃孵育1 h；每孔加入200 μl 1×washing buffer進行洗滌，方法同上；加入100 μl現(xiàn)配的AEC顯色液，25℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計數(shù) 96 孔板中每孔的斑點數(shù)。

1.7 CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗

通過離心收集靶細胞，并將細胞重懸于含有1% FCS的PBS中，并將細胞濃度調(diào)節(jié)至1×106/ml。致敏靶細胞：每1 ml細胞懸浮液加入0.5 μl 15 mmol/L羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester, CFSE)購自美國Sigma公司)，室溫，光照孵育4 min。對照靶細胞：每1 ml細胞懸液中加入0.5 μl 100 μmol/L CFSE，室溫，光照孵育4 min。將細胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細胞重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應細胞(前期誘導的CTL作為效應細胞)在無血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以 1.25×106～5×106細胞/ml的濃度重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應細胞(分別為12.5∶1、25∶1、50∶1)與致敏的靶細胞在離心管中混合，靶細胞數(shù)為 2×104，最終體積并在37℃溫育4 h孵育后，用含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同的E：T致敏的靶細胞組和對照靶細胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在4%多聚甲醛的PBS溶液中，流式細胞儀在機器檢測。殺傷率=(對照樣品中致敏靶細胞的數(shù)量-測試樣品中致敏靶細胞的數(shù)量)/對照樣品中致敏靶細胞的數(shù)量×100%。

1.8 LDH實驗檢測細胞毒性實驗

調(diào)整效應細胞濃度 2×106/ml；調(diào)整靶細胞MCF-7細胞濃度為1×105/ml，每孔加50 μl，即為5 000個/孔；按設置的效靶比加入效應細胞及各種對照組，每孔終體積為100 μl；37℃、CO2孵育箱中孵育4 h，孵育結(jié)束前45 min，在靶細胞最大釋放組和體積校正組中各加入10 μl裂解液；離心孔板，1 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清50 μl至96孔板中；每孔加入50 μl乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔加入50 μl終止液；在酶標儀上設置490 nm波長測定吸收值。殺傷率計算：靶細胞殺傷率(%)=[(實驗組吸光值-效應細胞自發(fā)釋放組吸光值-靶細胞自發(fā)釋放組吸光值)/(靶細胞最大釋放組吸光值-靶細胞自發(fā)釋放組吸光值)]×100%[13]。

1.9 細胞因子染色法檢測T細胞釋放IFN-γ水平

誘導的CTL作為效應細胞，荷肽的DC作為刺激細胞；陰性對照孔每孔加入1×106/ml的效應細胞，終體積為1 ml；陽性對照孔每孔加入1×106/ml的效應細胞和100 μl PHA再補加900 μl無血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入阻斷劑BFA 5 μg/ml到培養(yǎng)體系中，充分混勻。于培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2孵育4 h；孵育結(jié)束后，1 500 r/min，離心5 min，收集細胞，用含2% FBS溶液的PBS將細胞重懸。避光加入細胞表面抗體，4℃避光孵育20 min，1 500 r/min，離心5 min。用細胞染色溶液洗滌2次，收集細胞，每孔加入100 μl破膜劑，4℃孵育20 min。收集細胞，加入抗IFN-γ抗體，4℃避光孵育30 min；每管加入500 μl細胞染色溶液，重懸，轉(zhuǎn)移到Falcon圓底試管中上機檢測。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 CTNNA2在腫瘤組織中的表達情況

使用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫查詢CTNNA2在腫瘤病人組織中的表達情況，從數(shù)據(jù)庫中結(jié)果得知CTNNA2在肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌中均有表達。如圖1所示。

圖1 腫瘤組織中CTNNA2的表達Fig 1 Expression of CTNNA2 in tumor tissue

2.2 CTNNA2 HLA-A2限制性CTL表位的預測以及長肽的設計

預測CTNNA2蛋白開放閱讀框中潛在的HLA-A2超型限制性CTL表位，依據(jù) NetCTL1.2、SYFPEITHI和BIMAS軟件的結(jié)果，選取在各個預測軟件中分值排名靠前的表位肽。設計長肽的長度盡量選擇包含已經(jīng)預測的較好的9個氨基酸的肽段。所設計的長肽長度大概25個氨基酸左右。具體打分情況以及設計長肽結(jié)果見表1。

2.3 ELISPOT實驗檢測IFN-γ分泌水平

志愿者的PBMCs經(jīng)過GM-CSF和IL-4的誘導及LPS的刺激，成為成熟的DC。DC荷載長肽刺激PBMCs 3輪后，ELISPOT實驗檢測誘導能分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量。與PBS組相比，P129-156、P778-800、P857-880這3條長肽在志愿者中均誘導出了可以分泌IFN-γ的T淋巴細胞(圖2)。

2.4 LDH實驗檢測細胞毒性實驗

體外ELISPOT實驗顯示，3條長肽在志愿者中均能誘導分泌IFN-γ的T淋巴細胞，為了進一步驗證這3條長肽特異性的CTL對靶細胞是否有殺傷，選擇MCF-7作為靶細胞(CTNNA2+，HLA-0201+)進行LDH實驗。結(jié)果顯示(圖3)，當效靶比是50∶1時，P778-800、P857-880在志愿者中所誘導的CTL對靶細胞MCF-7的殺傷率分別為28.5%、35.2%。P129-156在志愿者中所誘導的CTL對靶細胞MCF-7的殺傷率較低，數(shù)據(jù)中并沒有顯示，圖3中只顯示了效果較好的2條長肽P778-800、P857-880。

表1 CTNNA2抗原HLA-A2限制性CTL表位預測結(jié)果Tab 1 Prediction scores of the peptide derived from CTNNA2

圖2 ELISPOT 檢測長肽在HLA-A2健康志愿者中誘導的CTLs的IFN-γFig 2 In long peptide-pulsed DC assay, IFN-γ release assayed by ELISPOT using long peptide-pulsed DC to induce CTLs from HLA-A2 healthy donor

圖3 長肽誘導的CTL在不同效靶比時對靶細胞的殺傷情況Fig 3 Specific lysis of MCF-7 by the CTLs induced by synthetic long peptide

2.5 CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗

候選肽所誘導產(chǎn)生的CTL隨著效靶比的提高殺傷效果相應提到。根據(jù)LDH實驗檢測細胞毒性實驗結(jié)果，將效果較好的P778-800、P857-880進一步的使用CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗；P778-800、P857-880 2條候選肽誘導得到的CTL在不同效靶比(12.5∶1、25∶1、50∶1)時對靶細胞的殺傷情況見圖4。P778-800、P857-880 2條候選肽誘導得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率分別是26.5%±1.86%和33.6%±1.26%，而陰性對照組PBS和無關(guān)肽組HBC在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率分別為 2.62%±1.58%、2.24%±2.02%。

圖4 CFSE法特異性CTL的體外細胞毒實驗結(jié)果Fig 4 Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donor

2.6 細胞因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平

從HLA-A2+健康供者得到的PBMCs，DC荷載長肽刺激PBMCs 3輪后，且體外培養(yǎng)18 d后，獲得特異性的CTL，細胞因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平。結(jié)果顯示(圖5)，P778-800、P857-880長肽疫苗能分泌較多的IFN-γ。

3 討論

惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢。在現(xiàn)代城市中，惡性腫瘤死亡率和發(fā)病率已超過心腦血管疾病高居首位[14]。隨著發(fā)展的生物分子機制方面的深入探索，生物治療已然成為治療惡性腫瘤的發(fā)展模式，腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的重要組成部分，為腫瘤的治療和預防開辟了新途徑。近年來腫瘤疫苗逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域之一，并且得到了十分迅速的發(fā)展[15]。腫瘤多肽疫苗可以很好的被樹突狀細胞處理并提呈給T淋巴細胞，從而引發(fā)肽特異性的CTL反應[16]。在蛋白疫苗的基礎(chǔ)上，通過對腫瘤抗原編碼基因的序列分析，分析其被CD8+T淋巴細胞識別的抗原表位，構(gòu)建多肽疫苗，能夠加強人類淋巴細胞抗原和T細胞受體(T cell receptor, TCR)的結(jié)合，而且還可以通過氨基酸替換、改變肽的構(gòu)象以及修飾氨基酸殘基等方法提高肽的免疫原性[17]。

圖5 細胞因子染色法檢測長肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力Fig 5 IFN-γ release ability assayed by intracellular cytokine staining assay >*P<0.05 vs PBS group

很多方法用于設計多表位長肽。經(jīng)典的方法將最小表位連接在一起，在表位間使用間隔區(qū)或連接子才能達到最佳處理效果，而其他研究則沒有[18]。用于多表位長肽設計的另一種方法包括應用超過17個氨基酸的“天然”肽，長肽需要蛋白酶體加工并將表位呈遞給CTL。長肽不僅包含CD4+和Th細胞表位而且包含CTL表位，它們不直接與非APC上表達的 HLA-Ⅰ類分子結(jié)合，且氨基酸序列較長，需要專業(yè)APCs如樹突狀細胞吞噬和處理長肽，然后分別在 HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子的背景下呈遞CTL和Th細胞表位[19]。與短肽相比，長肽更能克服免疫耐受的問題。

本研究結(jié)果顯示P778-800、P857-880有很好的分泌IFN-γ的能力及殺傷靶細胞的能力，表明 HLA-Ⅰ分子不僅限于短肽(8～10個殘基)，而且部分長肽可能具有更高的免疫原性[20]，因此需要進一步研究了解它們在免疫應答中的作用程度。長肽的結(jié)構(gòu)特征揭示了 HLA-Ⅰ裂隙的閉合構(gòu)象不是長表位結(jié)合的障礙，可能通過形成二級結(jié)構(gòu)(例如β-發(fā)夾或α-螺旋)來穩(wěn)定凸起的表位；盡管即使沒有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，凸起的表位也不一定是靈活的[21]。因此，與傳統(tǒng) pMHC-Ⅰ表面相比，長肽有戲劇性的表現(xiàn)，人們之前可能認為這會導致TCR識別下降。相反，這些凸起的表位仍然具有免疫原性，盡管這些表位通常選擇限制性TCR庫，但具有長肽的 TCR-pMHC-Ⅰ復合物已經(jīng)揭示出可能具有不同的TCR對接模式。進一步的研究將有必要確定一個短肽TCR對接策略是否優(yōu)于其他長肽的TCR對接策略。