宋 軍 馬賽君 羅建華 劉 卉 徐 麗 李 麗 張智廣 周瑞祥△

(1 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室， 福州 350122； 2 福州總醫(yī)院第二住院部檢驗科， 福州 350002)

胃癌是導(dǎo)致原發(fā)性癌癥死亡損失健康生命年(years of life lost，YLL)的第3大原因。2015年全球有130萬胃癌病例和81.9萬胃癌死亡病例[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率男性僅次于肺癌排第2，女性胃癌發(fā)病率在乳腺癌、肺癌之后排第3，是死亡率最高的幾種癌癥之一，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。褪黑素(melatonin，MLT)又名N乙酰5甲氧色胺，是一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素。研究表明，褪黑素具有抗腫瘤的作用，可以抑制胃癌、肝癌、乳腺癌[3]等多種腫瘤。褪黑素通過促進(jìn)凋亡，抑制增殖，調(diào)節(jié)免疫等多種途徑發(fā)揮抗癌作用，然而其抗癌作用的分子機制尚待明確。本研究選取人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和MGC803，探討褪黑素作用后對細(xì)胞周期及增殖的影響，并檢測與細(xì)胞周期及增殖相關(guān)蛋白的變化以闡明其抗胃癌作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MGC803購自上海細(xì)胞研究所。采用含10%胎牛血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 及MEM/F12培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。胎牛血清和培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。褪黑素購自美國Sigma-Aldrich公司，褪黑素溶于無水乙醇中，無水乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度不超過1%。CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)細(xì)胞增殖試劑盒購自美國Promega公司；BD PharmingenTMPI/RNase Staining Buffer購自美國BD公司；RIPA細(xì)胞強裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；蛋白酶抑制劑(cocktail)及蛋白磷酸酶抑制劑(PhosStop)購自瑞士Roche公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司；化學(xué)發(fā)光檢測底物CDP-STAR購自Roche公司；免疫印跡實驗(Western blotting)用的特異性抗體，包括CDC25A和磷酸化CDC25A(pCDC25A, phosphor S75)、p21和磷酸化p21(pp21, phosphor T145)抗體以及堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔抗體購自英國Abcam公司；GAPDH購自美國CST公司；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗鼠抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 褪黑素對胃癌細(xì)胞增殖作用的影響

采用CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)細(xì)胞增殖試劑盒分析褪黑素作用后細(xì)胞的增殖活性來選擇合適的作用濃度和作用時間。人胃癌細(xì)胞AGS、MGC803以1×104/ml的濃度接種于96孔板中，24 h后用1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素處理，并用加1%無水乙醇的細(xì)胞作為陰性對照。分別作用24、48、72 h加入MTS，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液做空白對照組，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測490 nm處的吸光度值來分析細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞增殖抑制率按如下公式計算：增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。并在倒置顯微鏡下觀察褪黑素處理胃癌細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 細(xì)胞周期分析

采用碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。AGS、MGC803用3 mmol/L褪黑素及處理24 h，以加入1%乙醇的培養(yǎng)細(xì)胞作為對照組(control)，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，加入PI后用流式細(xì)胞儀檢測，分析處于G0/G1、S、G2期的細(xì)胞百分率。

1.4 免疫印跡檢測

褪黑素處理細(xì)胞與加入1%乙醇溶劑的對照細(xì)胞(control)采用加入蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白質(zhì)抑制劑的強裂解液裂解，BCA法定量后，加入12%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，三明治法轉(zhuǎn)入PVDF上，0.5%牛血清封閉，加入以下幾種一抗4℃孵育過夜：CDC25A(1∶200 稀釋)、pCDC25A(phosphor S75，1∶1 000稀釋)、p21(p21Cip1/p21Waf1，1∶5 000稀釋)、pp21(phosphor Thr145，1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶1 000 稀釋)。PBS漂洗后加堿性磷酸酶連接的二抗室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光底物CDP STAR，化學(xué)發(fā)光儀檢測目的蛋白。用灰度分析軟件Image J2x分析其灰度值變化。褪黑素處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)灰度值除以對照細(xì)胞蛋白質(zhì)灰度值計算蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化，以此變化倍數(shù)為縱坐標(biāo)做直方圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 褪黑素作用引起細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化顯著

分別用0、1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素處理AGS、MGC803細(xì)胞24、48 h和72 h，MTS試劑盒分析細(xì)胞增殖活力。結(jié)果顯示，褪黑素可抑制AGS、MGC803細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性(圖1)。褪黑素處理濃度及時間以3 mmol/L和24 h為宜，其細(xì)胞抑制率在50%左右，濃度過高或時間過長使細(xì)胞死亡過多，難以進(jìn)行后期的試驗分析。倒置顯微鏡觀察，3 mmol/L褪黑素處理24 h AGS、MGC803與只加褪黑素溶劑乙醇的對照細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量減少，漂浮死亡細(xì)胞增多，胞體細(xì)長多角，形態(tài)出現(xiàn)明顯變化(圖2)。

2.2 褪黑素作用引起細(xì)胞周期阻滯于G1/S期

PI染色流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期顯示，褪黑素作用引起不同細(xì)胞周期細(xì)胞的分布發(fā)生變化。在AGS細(xì)胞中，褪黑素作用組較對照組細(xì)胞G0/G1期從50.28%

圖1 褪黑素作用人胃癌細(xì)胞AGS(A)、MGC803(B)細(xì)胞抑制率分析Fig 1 Percentage of cell inhibition in AGS(A) and MGC803(B) treated with melatonin

圖2 3 mmol/L褪黑素作用人胃癌細(xì)胞24 h的顯微鏡觀察Fig 2 Microscopic examination of human gastric cancer cells treated with 3 mmol/L melatonin for 24 h compared to control cells

±0.31% 上升到67.04%±1.46%(P<0.01)，S期從17.21%±1.22%下降到9.71%±0.58%(P<0.01)，G2/M 期從32.47%±1.12%下降到23.27%±1.91%(P<0.01)。G0/G1期細(xì)胞升高，S期和G2/M期細(xì)胞下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在MGC803細(xì)胞中，褪黑素作用組較對照組細(xì)胞G0/G1期從42.24%±1.27%上升到 47.66%±1.57%(P<0.01)，S期從12.68%±1.13%到 10.03±1.22%(P>0.05)，G2/M 期從44.84%±2.45%到41.88%±0.40%(P>0.05)。G0/G1期細(xì)胞升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；S期和G2/M期細(xì)胞差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。2種類型胃癌細(xì)胞褪黑素作用細(xì)胞周期分析見圖3。

2.3 褪黑素對AGS、MGC803細(xì)胞CDC25A和p21表達(dá)及其磷酸化水平的影響

細(xì)胞分裂周期蛋白CDC25A 及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白p21其表達(dá)及磷酸化水平可調(diào)控細(xì)胞周期的運行。采用免疫印跡的方法，用相應(yīng)蛋白的普通抗體及磷酸化抗體對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CDC25A及p21的表達(dá)及磷酸化水平進(jìn)行了分析，在2種胃癌細(xì)胞褪黑素作用后都出現(xiàn)CDC25A及p21表達(dá)的下調(diào)，相應(yīng)的CDC25A及p21的磷酸化水平也較對照組降低(圖4)。

圖3 3 mmol/L褪黑素作用24 h對人胃癌細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effect of 3 mmol/L melatonin for 24 h on cell cycle of human gastric cancer cells by flow cytometry

圖4 褪黑素作用AGS(A、C)、MGC803(B、D)細(xì)胞CDC25A(A、B)及p21(C、D)表達(dá)及磷酸化水平免疫印跡分析Fig 4 Western blotting analysis of the expression and phosphorylation of CDC25A(A,B) and p21(C,D) in AGS(A,C) and MGC803(B,D) with melatonin

3 討論

褪黑素是主要由松果體合成并分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素。除松果體外，其他組織和器官也合成褪黑素，如紋狀體、視網(wǎng)膜、脾、肝和胃腸道等[4]。褪黑素具有多種多樣的生理學(xué)功能，如：調(diào)節(jié)日夜節(jié)律，抑制生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)骨骼生長，抑制腫瘤發(fā)生，調(diào)節(jié)免疫，清除自由基抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護等作用[5-6]。褪黑素的抗腫瘤作用是目前褪黑素研究的熱點領(lǐng)域，研究表明褪黑素可以通過多種途徑抑制多種腫瘤，但是褪黑素作用的分子機制尚不十分明確。褪黑素可以抗胃癌。在胃腸道中，褪黑素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他組織，是松果體的400倍，比血清中含量高10～100倍。胃腸道組織細(xì)胞不僅可以分泌褪黑素，其上還有褪黑素受體，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮重要的保護和調(diào)節(jié)作用。研究表明褪黑素可以增強胃腸道的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)糞便水份，減緩腸道蠕動，保護胃腸道免受消化酶、胃酸以及外源性藥物的影響[7]。本課題組前期動物實驗表明，褪黑素可通過促進(jìn)凋亡、抑制增殖以及降低腫瘤組織局部CD4+CD25+Treg細(xì)胞抗鼠胃癌[8-9]。Li 等[10]研究褪黑素對胃癌細(xì)胞AGS的作用，認(rèn)為其可通過激活JNK和P38和抑制NF-κB途徑促進(jìn)AGS的凋亡。

為了進(jìn)一步研究褪黑素對人胃癌細(xì)胞的作用及其作用的分子機制，本研究采用AGS及MGC803作為體外模型，探索褪黑素對其細(xì)胞周期、增殖的影響及相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)分子機制。研究表明褪黑素可以誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞AGS及MGC803細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，抑制AGS及MGC803增殖。細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)分子CDC25A及p21表達(dá)及磷酸化水平下降，是褪黑素引起周期阻滯及增殖抑制的作用分子。

CDC25A(細(xì)胞分裂周期25A)是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，其本身為蛋白磷酸酶，可以使磷酸化的CDK4或CDK6 去磷酸化，從而激活cyclin D-CDK4/ CDK6復(fù)合體，驅(qū)動細(xì)胞周期從G1進(jìn)入S期。體外研究表明，增殖細(xì)胞內(nèi)微注射CDC25A的抗體，或者下調(diào)CDC25A的表達(dá)可以使細(xì)胞周期阻滯于G1/S期。CDC25A在S75位置上磷酸化可以使其穩(wěn)定，避免其泛素化降解，推動細(xì)胞周期的進(jìn)行[11]。褪黑素作用后S75位置上的CDC25A磷酸化水平下調(diào)，使其趨向泛素化降解，從而抑制細(xì)胞周期從G1進(jìn)入S期。CDC25A在多種惡性腫瘤如胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等中高表達(dá)，與不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示褪黑素作用MGC803細(xì)胞后引起CDC25A表達(dá)下調(diào)，磷酸化CDC25A(S75)下降促進(jìn)其分解，提示CDC25A可能是褪黑素誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞G1/S期周期阻滯，抑制其增殖的關(guān)鍵分子。

p21(p21Cip1/p21Waf1)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族CIP/KIP中的一員，可以激活細(xì)胞周期檢測點抑制細(xì)胞周期運行。由于p21可以與CDC25A的啟動子相結(jié)合從而抑制其表達(dá)，因此CDC25A的抑制曾被認(rèn)為是在DNA受損的情況下，通過p53上調(diào)p21來實現(xiàn)的。但在本研究中顯示，p21并不像預(yù)期的那樣升高而是下降。提示p21對細(xì)胞增殖的調(diào)控作用除了抑制作用之外還有其他的作用方式。目前已有研究表明，p21有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用。p21可以與cyclin/cdk 形成cyclin/cdk-p21復(fù)合物推動細(xì)胞周期的進(jìn)行；Martin等[12]在研究褪黑素抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用時也顯示p21下降的現(xiàn)象。另外，Rother 等[13]研究表明p53家族成員Tap63α和p73α可以上調(diào)p21，但不抑制CDC25A表達(dá)，說明p53對CDC25A的抑制可以不通過p21，表明p21及CDC25A同時下調(diào)是可能的。Zhang 等[14]研究表明，當(dāng)p21在Thr145上磷酸化時，可以促進(jìn)其穩(wěn)定并定位于細(xì)胞核，增強肺癌細(xì)胞H1299增殖，p21在腫瘤中的作用具有雙面性[15]。本研究結(jié)果顯示褪黑素作用后Thr145位點的磷酸化p21下調(diào)，抑制胃癌細(xì)胞增殖。

本研究通過分析褪黑素作用人胃癌細(xì)胞AGS、MGC803表明：褪黑素下調(diào)CDC25A、p21表達(dá)及其磷酸化，引起胃癌細(xì)胞G1/S期細(xì)胞周期阻滯，抑制胃癌細(xì)胞增殖，為明確褪黑素抑制胃癌的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。