吳慶珊， 雷　珣， 雷友梅， 蒲　星， 劉　穎， 翁慶北

(貴州師范大學生命科學學院， 貴州 貴陽 550001)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)隸屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)，為多年生草本植物[1]，多附生在陰涼通風的懸崖石壁上或樹上，主要分布在中國西南、華南和臺灣等地。金釵石斛在貴州省有50余年的栽培歷史，貴州省赤水市的金釵石斛在2006年由國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局批準實施國家地理標志產品保護。金釵石斛為中國傳統(tǒng)名貴中藥材和保健品原料，主要化學成分包括生物堿、多糖、倍半萜類、菲類、聯(lián)芐類等，具有抗腫瘤、抗衰老、改善記憶、提高免疫力、提高胃腸道功能及抗白內障等功效[2]，經濟價值很高。然而，金釵石斛種子自然萌發(fā)困難，隨著人們對金釵石斛的不斷開發(fā)利用，導致其野生資源日漸枯竭，因此，應建立完善的金釵石斛人工組培繁殖和保育體系，以加快金釵石斛的規(guī)范化和規(guī)模化種植。

植物內生細菌棲居于健康的植物組織和器官的細胞間隙或細胞內，不會對寄主植物造成實質性危害，并可與寄主植物建立和諧共生關系[3]。相關研究結果表明：蘭科植物具有依賴菌根成活和生長的特性[4-5]，其內生細菌的數(shù)量和種類因生境而異，并與蘭科植物的種類、根齡、生長季節(jié)及菌根真菌的定植程度等密切相關[6-8]。迄今為止，研究者們已經從90多種蘭科植物中分離出大量的內生細菌，并以根部內生細菌為主[9]，其中，已經分離出內生細菌的石斛屬植物有美花石斛(D.loddigesiiRolfe)[10]、細莖石斛〔D.moniliforme(Linn.) Sw.〕[11]、鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)[12]和杓唇石斛〔D.moschatum(Buch.-Ham.) Sw.〕[13]等。

在蘭科植物的整個微生態(tài)系統(tǒng)中，植物與其內生微生物相互作用，并且，內生細菌間、內生細菌與植物菌根真菌間的相互作用可直接或間接促進植物生長發(fā)育。植物內生細菌不僅可以通過生物固氮和分泌IAA等植物激素直接促進植物生長[5-8]，還可以通過誘導植物體產生植物激素、增強植物體抗逆性及防御病原體入侵等途徑間接促進植物生長發(fā)育[14-15]，因此，內生細菌對植物的生長和繁殖具有重要作用。相關研究結果表明：接種內生細菌可提高蘭科植物種子的萌發(fā)率[5-7]和組培苗煉苗移栽的成活率[13，16]，促進組培苗生長，并提高組培苗的生物產量及多糖等活性成分的含量。不同生長階段的蘭科植物對促生微生物的種類需求不同[9]，并且，內生細菌與菌根真菌混合接種的促生效果明顯優(yōu)于單獨接種菌根真菌[17]。綜上所述，蘭科植物內生細菌對維持蘭科植物的物種多樣性及其規(guī)?；瘓@藝栽培和藥用生產等具有重要意義。

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)是微生物研究的重要基礎，對豐富蘭科植物內生細菌資源，研究內生細菌的生物學特性及其與植物種子萌發(fā)和幼苗生長等的相互作用具有不可替代的作用。為此，作者從貴州省3個地區(qū)人工種植的金釵石斛根、莖和葉等器官中分離出內生細菌，并采用擴增核糖體DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)法對分離的內生細菌進行多樣性分析，以期豐富蘭科植物內生細菌的種質資源，為進一步利用內生細菌共生技術開展藥用植物栽培和活性天然產物分離等研究提供基礎數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1　研究地概況和研究方法

1.1　研究地概況

供試金釵石斛分別來自貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)(P1)、貴州省貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚(P2)和貴州省金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園大棚(P3)3個樣地，均于2015年9月采集。其中，P1樣地位于北緯28°32′01″、東經105°51′52″，海拔377 m，屬中亞熱帶濕潤季風氣候，年均溫18.1 ℃，年均空氣相對濕度82%，供試植株以壓石法仿野生種植[18]，栽培基質以苔蘚、腐熟牛肥和鋸木屑為主；P2樣地位于北緯26°35′31″、東經106°43′10″，海拔1 096 m，供試植株種植在大棚內，棚內溫度25 ℃～30 ℃，年均空氣相對濕度75%～85%，栽培基質以營養(yǎng)土和鋸木屑為主，基質含水量為50%～60%；P3樣地位于北緯27°29′53″、東經106°10′09″，海拔948 m，供試植株種植在大棚內，棚內溫度25 ℃～30 ℃，年均空氣相對濕度70%～80%，栽培基質以泥炭和珍珠巖為主，基質含水量為40%～60%。

1.2　研究方法

1.2.1樣株的采集方法采用五點取樣法在樣地內選擇正常生長且無病蟲害的2年生金釵石斛植株，每個采樣點采集1株樣株，同一樣地的5株樣株放入1個無菌袋中，置于冰盒中帶回實驗室，盡快用于內生細菌分離。經鑒定，樣株種植于貴州師范大學生命科學學院微生物實驗室進行活體保存。

1.2.2內生細菌的分離和純化用蒸餾水沖洗樣株表面，用濾紙吸干表面水分，每個樣地分別稱取根、莖和葉各2.0 g；先用體積分數(shù)75%乙醇進行消毒，根、莖和葉的消毒時間分別為3 min、2 min和30 s；接著用質量體積分數(shù)0.1% HgCl2溶液進行消毒，根、莖和葉的消毒時間分別為1 min、1 min和40 s；再用質量體積分數(shù)4% NaClO溶液進行消毒，根、莖和葉的消毒時間均為3 min；最后用無菌水漂洗3次。用無菌濾紙吸干根、莖和葉的表面水分，置于盛有18 mL無菌水的無菌研缽中研磨至勻漿，采用10倍梯度稀釋法用無菌水稀釋勻漿液，量取稀釋10、100和1 000倍的勻漿液各100 μL，分別均勻涂布在LB、NA、TB、YT、YPD、TSA、YG、R2A和KB培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃條件下倒置培養(yǎng)1～2 d，以菌落形成單位(colony forming unit，CFU)為準統(tǒng)計菌落總數(shù)。每個樣地金釵石斛根、莖和葉不同稀釋倍數(shù)的勻漿液均設置3個平行實驗。挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，使用相應的斜面培養(yǎng)基置于4 ℃條件下保存，或使用體積分數(shù)30%甘油置于-80 ℃條件下保存。

1.2.3細菌基因組DNA的提取使用相應的培養(yǎng)基將各菌株進行活化，并接種至5 mL相應的液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜；菌液在12 000 r·min-1條件下離心2 min，收集沉淀，參照董乙乂等[19]的方法提取細菌基因組DNA。

1.2.4ARDRA分析使用通用引物27F(引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(引物序列為5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)擴增細菌基因組DNA中16SrDNA的近全長片段；使用限制性內切酶HhaⅠ和HaeⅢ對擴增產物進行酶切分析，根據(jù)ARDRA的酶切產物帶型劃分不同的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。

選取每個OTU的代表性菌株，將擴增出的16SrDNA片段送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序；使用BLASTn程序(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)將測序獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行在線比對；下載與分離菌株16SrDNA序列最相似的菌株序列，使用Clustal W軟件進行多重比對；使用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法(neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復抽樣檢測1 000次；將每個OTU代表性菌株的16SrDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號。

1.3　數(shù)據(jù)分析

使用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)、Pielou均勻度指數(shù)(E)和Margalef豐富度指數(shù)(R)分析金釵石斛內生細菌的多樣性，使用S?renson相似性系數(shù)比較金釵石斛不同部位內生細菌組成的相似程度[20]。采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對相關數(shù)據(jù)進行處理，采用LSD法進行差異顯著性分析。

2　結果和分析

2.1　金釵石斛內生細菌的總體組成分析

統(tǒng)計結果表明：在貴州省的赤水市旺隆鎮(zhèn)、貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚和金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園3個樣地金釵石斛的根、莖和葉中共分離出1 081株內生細菌菌株；根據(jù)ARDRA分析結果，這些菌株可分成41個OTUs。每個OTU代表菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株16SrDNA序列的相似度及各OTU的分離菌株情況見表1；基于16SrDNA序列構建的各OTU代表菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表1金釵石斛內生細菌41個OTUs代表菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株16SrDNA序列的相似度及各OTU的分離菌株情況分析

Table1Similarityof16SrDNAsequencesbetweenrepresentativestrainsof41OTUsofendophyticbacteriainDendrobiumnobileLindl.andrelativestrainsinGenBankdatabase，andanalysisonstatusofisolatedstrainsofeachOTU

OTU編號 No.of OTU代表菌株 Representativestrain近緣菌株 Relativestrain編號No.登錄號Accessionnumber種類Species登錄號Accessionnumber相似度/%Similarity分離菌株 Isolatedstrain數(shù)量Number比例/%Percentage變形菌門Proteobacteria OTU33SJNA66KX131116BurkholderiaferrariaeNR043890.19830.3 OTU10SJNA1KX131107BurkholderiatropicaNR028965.198363.3 OTU4SJYG6KX131106Paraburkholderiaphytofir-mansNR102845.199323.0 OTU23PGKB36KX131131PantoeaagglomeransNR111998.19810.1 OTU29SGYPD246KX131110DyellathiooxydansNR116006.199282.6 OTU20SGR2A196KX131117LuteibacterrhizovicinusNR042197.19910.1厚壁菌門Firmicutes OTU14PGNA11KX131100PaenibacilluscinerisNR042189.199605.6 OTU39WGR2A5KX131124PaenibacilluspeoriaeNR042092.19910.1 OTU18SGYG14KX131109PaenibacillusvulnerisNR117618.19960.6 OTU2SGLB131KX131108BrevibacillusinvocatusNR041836.19921920.3 OTU34SGTSA118KX131114BrevibacilluspanacihumiNR044485.110010.1 OTU13SGLB263KX131111CohnellaformosensisNR109515.198232.1 OTU27WGLB8KX131127SporosarcinasoliNR043527.110020.2 OTU15LYR2A1KX131094BacillusaeriusNR118439.199444.1 OTU1LGTSA3KX131092BacillusanthracisNR074453.19950.5 OTU21LGTSA8KX131095BacillusaryabhattaiNR115953.1100555.1 OTU30WGLB3KX131126BacillushuizhouensisNR133974.19910.1 OTU16WGLB7KX131120BacilluscecembensisNR042648.19910.1 OTU7LGTB5KX131096BacilluscereusNR074540.1100605.6 OTU26WGLB11KX131125BacilluscirculansNR112632.110020.2 OTU8WGYT20KX131129BacilluspocheonensisNR041377.110020.2 OTU40PGLB15KX131102BacillusrhizosphaeraeNR108311.19910.1 OTU17FGTSA29KX131089BacillusflexusNR113800.110020.2 OTU28WGKB24KX131122BacillushumiNR025626.19920.2 OTU38WGKB19KX131123BacilluskochiiNR117050.19910.1 OTU11WGKB13KX131119BacillussonorensisNR025130.19940.4 OTU9WGTB31KX131121BacillusmegateriumNR112636.110020.2 OTU24FGTB1KX131088BacillusvelezensisNR075005.29910.1 OTU31PJNA3KX131101BacillusmojavensisNR118290.19910.1 OTU25WGNA9KX131128BacillusniabensisNR043334.19910.1 OTU22WGLB13KX131118BacillusoceanisediminisNR117285.19910.1 OTU32PGLB7KX131099BacillusoleroniusNR043325.19920.2 OTU19PGKB24KX131104BacillusstratosphericusNR118441.110010.1 OTU12FGYG1KX131090BacillussubtilisNR112629.110020.2 OTU3LJTSA10KX131093Bacillussubtilissubsp.sub-tilisNR102783.19945942.5 OTU36WGTB24KX131132BacillusthuringiensisNR114581.19910.1 OTU5LGLB9KX131097BacillustoyonensisNR121761.1100121.1 OTU35FGLB29KX131091FictibacillusphosphorivoransNR118455.19920.2 OTU41LJYT25KX131133LysinibacillusfusiformisNR042072.19910.1 OTU37SGYPD103KX131112LysinibacillusmacroidesNR114920.19910.1 OTU6SGKB158KX131115LysinibacillusxylanilyticusNR116698.19910.1總計Total1081100.0

分支上的數(shù)值為1 000次重復抽樣檢測的自展支持率 Datums on the branches are the bootstrap values of 1 000 replications. 括號內的編號為近緣菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號 Nos. in brackets are accession numbers of relative strains in GenBank database. 大寫字母和數(shù)字組合為各OTU代表菌株的編號 Combinations of capitals and numbers are Nos. of representative strains of each OTU.圖1　基于16S rDNA序列構建的金釵石斛內生細菌各OTU代表菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1　Phylogenetic tree of representative strains of each OTU of endophytic bacteria in Dendrobium nobile Lindl. and relative strains in GenBank database based on 16S rDNA sequences

結果表明：分離的菌株屬于厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)2門，包括5科12屬40種1亞種，且各OTU代表菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株16SrDNA序列的相似度為98%～100%。

屬于厚壁菌門的OTUs有35個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的90.7%，包括芽孢桿菌科(Bacillaceae)和類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)2科共7屬，其中，芽孢桿菌科包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和虛構芽孢桿菌屬(Fictibacillus)3屬，類芽孢桿菌科包括短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)和柯恩氏菌屬(Cohnella)4屬。進一步分析結果表明：屬于芽孢桿菌屬的OTUs有24個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的61.3%；屬于類芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬的OTUs各有3個，分離菌株數(shù)分別占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的6.2%和0.3%；屬于短芽孢桿菌屬的OTUs有2個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的20.4%；屬于柯恩氏菌屬、芽孢八疊球菌屬和虛構芽孢桿菌屬的OTUs各只有1個，分離菌株數(shù)分別占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的2.1%、0.2%和0.2%。

屬于變形菌門的OTUs有6個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的9.3%，包括伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)3科共5屬，其中，伯克氏菌科包括伯克氏菌屬(Burkholderia)和副伯克氏菌屬(Paraburkholderia)2屬，黃單胞菌科包括藤黃桿菌屬(Luteibacter)和戴氏菌屬(Dyella)2屬，腸桿菌科僅泛菌屬(Pantoea)1屬。進一步分析結果表明：屬于伯克氏菌屬的OTUs有2個，屬于副伯克氏菌屬、戴氏菌屬、泛菌屬和藤黃桿菌屬的OTUs各只有1個，分離菌株數(shù)分別占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的3.6%、3.0%、2.6%、0.1%和0.1%。

從分離菌株數(shù)的比例來看，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為金釵石斛內生細菌的優(yōu)勢屬；Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus為優(yōu)勢種(亞種)，分離菌株數(shù)分別占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的42.5%和20.3%。

2.2　金釵石斛不同器官內生細菌的組成及多樣性分析

2.2.1組成分析研究結果(表2)表明：從金釵石斛根中分離出695株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的64.3%，包括12屬38種1亞種；從莖和葉中各分離出232和154株內生細菌菌株，分別占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的21.5%和14.2%，分別包括7屬13種1亞種和6屬11種1亞種。進一步分析結果表明：OTU31和OTU41僅在金釵石斛莖中分離獲得，其余39個OTUs均可在金釵石斛根中分離獲得，其中的24個OTUs僅能在根中分離獲得，但分離菌株數(shù)較少；金釵石斛根、莖和葉中內生細菌的共有OTUs有9個。

結合表1，從分離菌株數(shù)的比例來看，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為金釵石斛根、莖和葉內生細菌的優(yōu)勢屬，Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus為優(yōu)勢種(亞種)；并且，Burkholderiatropica、Paenibacilluscineris、Paraburkholderiaphytofirmans、Brevibacillusinvocatus、Bacillusaerius、Bacillusaryabhattai、Bacilluscereus、Bacillussubtilissubsp.subtilis和Bacillustoyonensis8種1亞種細菌在金釵石斛的根、莖和葉中均有分布。

表2不同器官、樣地和培養(yǎng)基中金釵石斛內生細菌41個OTUs的分離菌株數(shù)量分析1)

Table2Analysisonisolatedstrainnumberof41OTUsofendophyticbacteriafromDendrobiumnobileLindl.indifferentorgans，plots，andmedia1)

OTU編號 No.ofOTU器官2) Organ2)樣地3) Plot3)培養(yǎng)基 MediumRSLP1P2P3TSANALBR2AKBYGTBYPDYT變形菌門Proteobacteria OTU3312——3——111————— OTU1022104111114625365422 OTU4291217961146—1289 OTU231——1——————1———— OTU2925—31198521421481 OTU201———1————1—————厚壁菌門Firmicutes OTU143814829171410817654352 OTU391——1—————1————— OTU185—13121111—11—— OTU21086447886170304132411513111818 OTU341———1—1———————— OTU13212—1184222724121 OTU272——1—1—1——————1 OTU15317625910587846241 OTU15——3111111———1— OTU214744281215127111247——2 OTU301——1————1—————— OTU161——1————1—————— OTU740137341313101213935—35 OTU262——2————1—————1 OTU82——2————1—————1 OTU401————1——1—————— OTU1711—11—11——————— OTU282——2————1—1———— OTU381————1————1———— OTU114——2111——11——1— OTU92——1—11—————1—— OTU241———1———————1—— OTU31—1———1—1——————— OTU251——1———1——————— OTU221——1————1—————— OTU322——1—1——1——1——— OTU191————1————1———— OTU121—1—11—1———1——— OTU3279110702071271256888102981611352219 OTU361——1————————1—— OTU59216421121—3121 OTU352——1—1——1—1———— OTU41—1———1————————1 OTU371———1————————1— OTU61———1—————1————總計Total6952321544932932951561802082016463677765

1)—： 未分離出內生細菌 No endophytic bacterium isolated.

2)R： 根 Root； S： 莖 Stem； L： 葉 Leaf.

3)P1： 貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn) Wanglong Town in Chishui City of Guizhou Province； P2： 貴州省貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚 Greenhouse of School of Life Sciences of Guizhou Normal University in Guiyang City of Guizhou Province； P3： 貴州省金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園 Taijin Ecological Agricultural Sightseeing Garden in Jinsha County of Guizhou Province.

2.2.2多樣性分析從分離自金釵石斛根、莖和葉的內生細菌多樣性分析結果(表3)來看，根中內生細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和Margalef豐富度指數(shù)(R)最高，分別為2.20和5.81；莖中內生細菌的H′和R值分別為1.57和2.39，葉中內生細菌的H′和R值分別為1.71和2.18。從Pielou均勻度指數(shù)(E)來看，葉中內生細菌的E值最高，為0.69；根和莖中內生細菌的E值相近，分別為0.60和0.59。

S?renson相似性系數(shù)分析結果表明：金釵石斛葉和莖間、根和葉間以及根和莖間內生細菌的S?renson相似性系數(shù)分別為0.82、0.55和0.57，并且，葉和莖間內生細菌的S?renson相似性系數(shù)顯著高于根和葉間以及根和莖間內生細菌的S?renson相似性系數(shù)(P<0.05)。

表3金釵石斛不同器官內生細菌的多樣性分析

Table3DiversityanalysisonendophyticbacteriaindifferentorgansofDendrobiumnobileLindl.

器官Organ分離菌株數(shù)IsolatedstrainnumberOTU數(shù)量OTUnumberShannon-Wiener多樣性指數(shù)Shannon-WienerdiversityindexMargalef豐富度指數(shù)MargalefrichnessindexPielou均勻度指數(shù)Pielouevennessindex根Root695392.205.810.60莖Stem232141.572.390.59葉Leaf154121.712.180.69

2.3　不同樣地金釵石斛內生細菌的組成及多樣性分析

2.3.1組成分析研究結果(表2)表明：從貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)(P1)的金釵石斛中分離出493株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的45.6%，包括10屬28種1亞種；從貴州省貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚(P2)的金釵石斛中分離出293株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的27.1%，包括9屬21種1亞種；從貴州省金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園(P3)的金釵石斛中分離出295株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的27.3%，包括10屬23種1亞種。進一步分析結果表明：P1、P2和P3樣地金釵石斛內生細菌的特有OTUs分別有10、6和5個；3個樣地金釵石斛內生細菌的共有OTUs有14個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的96.5%。

結合表1，從分離菌株數(shù)的比例來看，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為3個樣地金釵石斛內生細菌的優(yōu)勢屬，Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus為優(yōu)勢種(亞種)；并且，不同樣地金釵石斛的內生細菌存在一定差異，例如：泛菌屬僅分離自P1樣地的金釵石斛，藤黃桿菌屬僅分離自P2樣地的金釵石斛，而芽孢八疊球菌屬未分離自P2樣地的金釵石斛，賴氨酸芽孢桿菌屬未分離自P1樣地的金釵石斛。

2.3.2多樣性分析從分離自3個樣地金釵石斛的內生細菌多樣性分析結果(表4)來看：P1樣地金釵石斛內生細菌的Margalef豐富度指數(shù)(R)明顯高于P2和P3樣地；而3個樣地金釵石斛內生細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)和Pielou均勻度指數(shù)(E)差異較小，其中，P1樣地金釵石斛內生細菌的H′值略高于P2和P3樣地，而P2樣地金釵石斛內生細菌的E值則略高于P1和P3樣地。

表4不同樣地金釵石斛內生細菌的多樣性分析

Table4DiversityanalysisonendophyticbacteriaofDendrobiumnobileLindl.indifferentplots

樣地1)Plot1)分離菌株數(shù)IsolatedstrainnumberOTU數(shù)量OTUnumberShannon-Wiener多樣性指數(shù)Shannon-WienerdiversityindexMargalef豐富度指數(shù)MargalefrichnessindexPielou均勻度指數(shù)PielouevennessindexP1493292.064.520.61P2293221.973.520.65P3295241.933.870.62

1)P1： 貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn) Wanglong Town in Chishui City of Guizhou Province； P2： 貴州省貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚 Greenhouse of School of Life Sciences of Guizhou Normal University in Guiyang City of Guizhou Province； P3： 貴州省金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園 Taijin Ecological Agricultural Sightseeing Garden in Jinsha County of Guizhou Province.

2.4　不同培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌的組成及數(shù)量分析

2.4.1組成分析研究結果(表2)表明：TSA培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出156株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的14.4%，包括7屬16種1亞種；NA培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出180株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的16.7%，包括8屬18種1亞種；LB培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出208株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的19.2%，包括8屬22種1亞種；R2A培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出201株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的18.6%，包括8屬16種1亞種；KB培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出64株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的5.9%，包括9屬15種1亞種；YG培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出63株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的5.8%，包括7屬13種1亞種；TB培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出67株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的6.2%，包括7屬12種1亞種；YPD培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出77株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的7.1%，包括8屬12種1亞種；YT培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出65株內生細菌菌株，占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的6.0%，包括9屬14種1亞種。進一步分析結果表明：TSA、YPD和YT培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌均有1個特有OTU，NA、R2A和TB培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌均有2個特有OTUs，LB和KB培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌分別有3和4個特有OTUs，而YG培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌無特有OTU；9種培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌共有OTUs有7個。

結合表1，從分離菌株數(shù)的比例來看，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為9種培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌的優(yōu)勢屬，Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus為優(yōu)勢種(亞種)。

2.4.2數(shù)量分析統(tǒng)計結果(表5)表明：NA培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)最多，為10.67×105CFU·g-1；R2A培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)次之，為10.20×105CFU·g-1；KB培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)最少，僅為1.76×105CFU·g-1。供試9種培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)，并且，TSA、NA、LB和R2A培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)顯著高于KB、YG、TB、YPD和YT培養(yǎng)基。另外，TSA、NA、LB、R2A和KB培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌OTU數(shù)量均較多(15～20個OTUs)，而YG、TB、YPD和YT培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌OTU數(shù)量卻較少(9～10個OTUs)。

由表5可見：LB培養(yǎng)基從金釵石斛莖中分離出的內生細菌菌落數(shù)最多，為10.47×104CFU·g-1；KB培養(yǎng)基從金釵石斛莖中分離出的內生細菌菌落數(shù)次之，為9.23×104CFU·g-1；NA培養(yǎng)基從金釵石斛莖中分離出的內生細菌菌落數(shù)最少，僅為3.70×104CFU·g-1。供試9種培養(yǎng)基從金釵石斛莖中分離出的內生細菌菌落數(shù)無顯著差異。另外，9種培養(yǎng)基從金釵石斛莖中分離出的內生細菌OTU數(shù)量差異較小(7～11個OTUs)。

培養(yǎng)基Medium根 Root莖 Stem葉 Leaf菌落數(shù)/CFU·g-1ColonynumberOTU數(shù)量OTUnumber菌落數(shù)/CFU·g-1ColonynumberOTU數(shù)量OTUnumber菌落數(shù)/CFU·g-1ColonynumberOTU數(shù)量OTUnumberTSA(9.96±1.02)×105a15(5.43±1.88)×104a8(9.53±1.56)×103ab8NA(10.67±1.16)×105a16(3.70±0.38)×104a9(4.30±1.68)×103ab5LB(9.40±2.03)×105a20(10.47±1.27)×104a11(10.13±1.51)×103a9R2A(10.20±0.96)×105a15(8.50±1.36)×104a10(7.10±0.96)×103ab7KB(1.76±0.32)×105b16(9.23±0.99)×104a10(5.25±1.78)×103ab5YG(5.52±2.09)×105b10(6.47±0.98)×104a9(2.93±1.54)×103b4TB(2.80±1.41)×105b10(7.17±0.95)×104a8(9.03±0.41)×103ab8YPD(3.68±1.17)×105b9(4.70±2.21)×104a7(5.90±1.66)×103ab6YT(4.27±0.85)×105b10(5.50±2.10)×104a7(5.40±1.33)×103ab6

1)同列中的不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基從同一器官中分離的內生細菌菌落數(shù)差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference in colony number of endophytic bacteria isolated from the same organ among different media (P<0.05).

由表5還可見：LB培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)最多，為10.13×103CFU·g-1；TSA培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)次之，為9.53×103CFU·g-1；YG培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)最少，僅為2.93×103CFU·g-1。供試9種培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，并且，LB培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)顯著高于YG培養(yǎng)基，而二者與其余7種培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)差異不顯著。另外，供試9種培養(yǎng)基從金釵石斛葉中分離出的內生細菌OTU數(shù)量較少(4～9個OTUs)。

比較分析結果表明：供試9種培養(yǎng)基從金釵石斛根中分離出的內生細菌菌落數(shù)和OTU數(shù)量均最多，從金釵石斛莖中分離出的內生細菌菌落數(shù)和OTU數(shù)量居中，而從金釵石斛葉中分離出的內生細菌菌落數(shù)和OTU數(shù)量均最少。

3　討論和結論

蘭科植物的內生細菌對宿主植物的生長、抗病和抗逆性等具有重要作用，因此，分離純化金釵石斛的內生細菌并研究其組成有助于闡明內生細菌在與金釵石斛共生過程中的功能和作用。本研究從金釵石斛中共分離出1 081株內生細菌菌株，隸屬2門5科12屬，可劃分為41個OTUs，并且，金釵石斛的內生細菌具有較高的遺傳多樣性。據(jù)不完全統(tǒng)計，從蘭科植物中分離出的內生細菌不少于60種，并且，蘭科植物內生細菌的組成差異與其生境不同有關[8-9]；Tsavkelova等[8]和Wilkinson等[21]的研究結果表明：芽孢桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)為蘭科植物內生細菌的優(yōu)勢屬，常見內生細菌還包括類芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)和賴氨酸芽孢桿菌屬等[10-13]；本研究中，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為金釵石斛內生細菌的優(yōu)勢屬，并且未從金釵石斛體內分離出假單胞菌屬內生細菌。作者還采用相同培養(yǎng)基對金釵石斛根際土壤進行了細菌分離實驗，同樣得出芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢屬的結論(另文發(fā)表)。另外，芽孢八疊球菌屬、柯恩氏菌屬和虛構芽孢桿菌屬在蘭科植物內生細菌研究中鮮見報道。推測蘭科植物內生細菌組成差異除了與生境有關外，還可能與寄主植物種類密切相關。

蘭科植物的許多內生細菌對植物的種子萌發(fā)和植株生長具有促生作用，被稱為植物促生細菌(plant growth promoting bacteria，PGPB)。在金釵石斛分離的內生細菌中，OTU40的代表菌株PGLB15與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株Bacillusrhizosphaerae(登錄號NR108311.1)16SrDNA序列的相似度為99%，OTU10的代表菌株SJNA1與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株Burkholderiatropica(登錄號NR028965.1)16SrDNA序列的相似度為98%，OTU9的代表菌株WGTB31與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株Bacillusmegaterium(登錄號NR112636.1)16SrDNA序列的相似度為100%，并且，這些近緣菌株均具有固氮作用[22-23]，據(jù)此推測這些代表菌株可能為金釵石斛生長提供氮素營養(yǎng)。另外，在金釵石斛分離的內生細菌中，OTU24的代表菌株FGTB1與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株Bacillusvelezensis(登錄號NR075005.2)16SrDNA序列的相似度為99%，OTU4的代表菌株SJYG6與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株Paraburkholderiaphytofirmans(登錄號NR102845)16SrDNA序列的相似度為99%，并且，這2種近緣菌株對植物均具有一定的促生作用[24-25]，據(jù)此推測這2種代表菌株對金釵石斛也有促生作用。研究表明：細莖石斛的許多內生菌具有解磷、解鉀、產生長素及產嗜鐵素的能力[11]；杓唇石斛的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)和分枝菌屬(Mycobacterium)內生細菌[8]及鐵皮石斛根中Sphingomospaucimmobilis和Paenibacillusmucilaginosus等內生細菌[16]對宿主植物均具有促生作用。已有研究表明：金釵石斛的多株內生細菌具有產IAA和解鉀等活性，并對玉米(ZeamaysLinn.)種子萌發(fā)和幼苗生長具有促生作用[26]。然而，關于內生細菌促進蘭科植物生長的機制尚未明確，關于金釵石斛內生細菌的促生作用也未可知，均有待深入研究。

由于植株各營養(yǎng)器官所處的微環(huán)境不同，導致植物內生細菌在器官中的分布存在差異，部分內生細菌具有明顯的組織偏向性。本研究結果表明：金釵石斛根中內生細菌的菌落數(shù)和多樣性均高于莖和葉；在分離出的12屬41個OTUs中，有2個OTUs僅能在莖中分離獲得，其余39個OTUs均可在根中分離獲得，且其中的24個OTUs僅能在根中分離獲得。推測造成上述結果的原因可能是由于金釵石斛根際土壤中的細菌含量豐富且多樣性較高(另文發(fā)表)，并且，金釵石斛海綿狀結構組織的氣根為內生細菌提供了適宜的棲居生境，更易被根際土壤中的細菌成功定植[5，8]。另外，金釵石斛葉和莖間內生細菌的S?renson相似性系數(shù)(0.82)顯著高于葉和根間(0.55)以及莖和根間(0.57)內生細菌的S?renson相似性系數(shù)，這可能與金釵石斛葉和莖中含有較高含量的石斛堿有關[2]，推測石斛堿的積累可能對金釵石斛的內生細菌具有選擇作用，因此，關于金釵石斛內生細菌組成與石斛堿的關系有待進一步深入研究。

微生物可借助空氣和雨水等，通過植物表面?zhèn)诨驓饪讖娜~表面進入體內，但根部裂紋仍是目前細菌在植物體內定植的最主要“熱點”[25]。本研究中，金釵石斛內生細菌菌株PGLB15、FGTB1、SGLB263、SGKB158、SGYPD246、SGR2A196、WGLB3、WGKB13、WGKB24、WGLB8和WGYT20等與已報道的土壤細菌16SrDNA序列具有較高的相似性[22，24，27-35]；并且，金釵石斛內生細菌中16個OTUs的代表菌株與金釵石斛根際土壤中分離的細菌16SrDNA序列具有較高的相似性(97%～100%)(另文發(fā)表)，但內生細菌的多樣性低于根際土壤細菌，而內生細菌中Cohnella、Sporosarcina、Dyella、Luteibacter和Pantoea的種類并未在金釵石斛根際土壤中分離獲得，說明金釵石斛特別是根部的內生細菌與其根際土壤細菌間既存在一定的相似性，也存在一定的特異性。值得注意的是，金釵石斛代表菌株SGLB263和SGKB158的近緣菌株均具有降解木聚糖的作用[27-28]，說明這2種內生細菌可能通過分解表皮和細胞壁進入金釵石斛體內，并以組織中的纖維素為碳源，順利定植于體內。

研究表明：植物內生細菌間以及內生細菌與宿主植物間存在和諧與競爭的關系[36]。貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)(P1)、貴州省貴陽市貴州師范大學生命科學學院大棚(P2)和貴州省金沙縣臺金生態(tài)農業(yè)觀光園(P3)的金釵石斛內生細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)差異較小，3個樣地金釵石斛內生細菌的共有OTUs有14個，分離菌株數(shù)占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的96.5%，且優(yōu)勢屬均為芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬，優(yōu)勢種(亞種)均為Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus，據(jù)此推測這3個樣地金釵石斛的來源相同，且內生細菌的優(yōu)勢屬和優(yōu)勢種(亞種)與金釵石斛的生長發(fā)育有關。Wilkinson等[37]認為，蘭科植物內生細菌的優(yōu)勢屬隨地區(qū)和季節(jié)，尤其是基于菌根菌侵染的組織形態(tài)不同而發(fā)生變化，且不同地區(qū)間存在差異；童文君等[10]也認為，不同產地美花石斛的內生細菌存在地區(qū)特異性。本研究中，供試3個樣地金釵石斛內生細菌的特有OTUs共21個，但分離菌株數(shù)較少，僅占金釵石斛內生細菌分離菌株總數(shù)的2.4%，推測這可能與不同樣地的環(huán)境和栽培條件有關。

本研究中，不同培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出的內生細菌的菌株數(shù)量和種類存在差異；與營養(yǎng)成分含量較高的YPD、YT和YG培養(yǎng)基相比，NA、TSA、LB、KB、R2A和TB培養(yǎng)基分離出的金釵石斛內生細菌的菌落數(shù)和OTU數(shù)量更多。郭斌等[38]認為，多數(shù)微生物更傾向于生長在與其自然環(huán)境相近的基質中。當在貧營養(yǎng)的植物體內生長的微生物突然被轉移到富營養(yǎng)的培養(yǎng)基中時，將導致其新陳代謝反應失衡，不利于其生長[36]。R2A是一種貧營養(yǎng)型培養(yǎng)基，含有的丙酮酸鈉能夠降解微生物培養(yǎng)過程中產生的毒性氧[39]，因而，該培養(yǎng)基從金釵石斛中分離出的內生細菌的菌株數(shù)量和種類較豐富。

綜上所述，金釵石斛內生細菌資源豐富，且其內生細菌的組成和多樣性與分離器官、種植地及培養(yǎng)基密切相關；其中，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為金釵石斛內生細菌的優(yōu)勢屬，Bacillussubtilissubsp.subtilis和Brevibacillusinvocatus為優(yōu)勢種(亞種)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 2010年版(一部)[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 85-86.

[2]乙引， 陳玲， 張習敏. 金釵石斛研究[M]. 北京： 電子工業(yè)出版社， 2009： 6.

[3]JAMES E K， OLIVARES F L. Infection and colonization of sugar cane and other graminaceous plants by endophytic diazotrophs[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1997， 17(1)： 77-119.

[4]SHAO S C， BURGESS K S， CRUSE-SANDERS J M， et al. Usinginsitusymbiotic seed germination to restore over-collected medicinal orchids in southwest China[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 888.

[5]PAVLOVA A S， LEONTIEVA M R， SMIRNOVA T A， et al. Colonization strategy of the endophytic plant growth-promoting strains ofPseudomonasfluorescensandKlebsiellaoxytocaon the seeds， seedlings and roots of the epiphytic orchid，DendrobiumnobileLindl.[J]. Journal of Applied Microbiology， 2017， 123(1)： 217-232.

[6]FARIA D C， DIAS A C F， MELO I S， et al. Endophytic bacteria isolated from orchid and their potential to promote plant growth[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 29(2)： 217-221.

[7]TSAVKELOVA E A， EGOROVA M A， LEONTIEVA M R， et al.DendrobiumnobileLindl. seed germination in co-cultures with diverse associated bacteria[J]. Plant Growth Regulation， 2016， 80(1)： 1-13.

[8]TSAVKELOVA E A， CHERDYNTSEVA T A， BOTINA S G， et al. Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin[J]. Microbiological Research， 2007， 162(1)： 69-76.

[9]張萍， 宋希強. 蘭科植物內生細菌物種多樣性及其促生機理研究進展[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2012， 20(1)： 92-98.

[10]童文君， 張禮， 薛慶云， 等. 不同產地美花石斛內生細菌分離及促生潛力比較[J]. 植物資源與環(huán)境學報， 2014， 23(1)： 16-23.

[11]張禮， 童文君， 薛慶云， 等. 細莖石斛內生和根圍細菌多樣性及促生能力分析[J]. 植物資源與環(huán)境學報， 2015， 24(3)： 32-40.

[12]王明月， 陶茜， 李克艷， 等. 鐵皮石斛內生細菌群落結構分析[J]. 西部林業(yè)科學， 2014， 43(5)： 106-111.

[13]TSAVKELOVA E A， CHERDYNTSEVA T A， NETRUSOV A I. Bacteria associated with the roots of epiphyticorchids[J]. Microbiology， 2004， 73(6)： 825-831.

[14]AHEMAD M， KIBRET M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria： current perspective[J]. Journal of King Saud University-Science， 2014， 26(1)： 1-20.

[15]SINGH S P， GAUR R. Evaluation of antagonistic and plant growth promoting activities of chitinolytic endophytic actinomycetes associated with medicinal plants againstSclerotiumrolfsiiin chickpea[J]. Journal of Applied Microbiology， 2016， 121(2)： 506-518.

[16]俞婕， 趙凱鵬， 董飛， 等. 野生鐵皮石斛內生菌的分離及促生作用研究[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技， 2010(9)： 96-97.

[17]DA SILVA J A T， TSAVKELOVA E A， ZENG S， et al. Symbioticinvitroseed propagation ofDendrobium： fungal and bacterial partners and their influence on plant growth and development[J]. Planta， 2015， 242(1)： 1-22.

[18]付芳婧， 劉政. 金釵石斛優(yōu)良種源的適生條件及仿野生栽培的關鍵技術[J]. 種子， 2012， 31(7)： 137-139.

[19]董乙乂， 艾義郎， 黃煜， 等. 人類活動對織金洞洞穴水中可培養(yǎng)細菌多樣性的影響[J]. 貴州師范大學學報(自然科學版)， 2017， 35(4)： 64-70， 76.

[20]WHITTAKER R H. Evolution and measurement of species diversity[J]. Taxon， 1972， 21(2/3)： 213-251.

[21]WILKINSON K G， SIVASITHAMPARAM K， DIXON K W， et al. Identification and characterization of bacteria associated with western Australian orchids[J]. Soil Biology Biochemistry， 1994， 26(1)： 137-142.

[22]MADHAIYAN M， POONGUZHALI S， LEE J-S， et al.Bacillusrhizosphaeraesp. nov.， an novel diazotrophic bacterium isolated from sugarcane rhizosphere soil[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2011， 100(3)： 437-444.

[23]REIS V M， SANTOS P E-D I， TENORIO-SALGADO S， et al.Burkholderiatropicasp. nov.， a novel nitrogen-fixing， plant-associated bacterium[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2004， 54(6)： 2155-2162.

[24]CHEN X H， KOUMOUTSI A， SCHOLZ R， et al. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacteriumBacillusamyloliquefaciensFZB42[J]. Nature Biotechnology， 2007， 25(9)： 1007-1014.

[25]HARDOIM P R， VAN OVERBEEK L S， VAN ELSAS J D. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth[J]. Trends in Microbiology， 2008， 16(10)： 463-471.

[26]高陽， 朱雙麗， 吳慶珊， 等. 金釵石斛IAA內生細菌篩選及對干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)的影響[J]. 種子， 2017， 36(4)： 36-41.

[27]HAMEED A， HUNG M-H， LIN S-Y， et al.Cohnellaformosensissp. nov.， a xylanolytic bacterium isolated from the rhizosphere ofMedicagosativaL.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2013， 63(8)： 2806-2812.

[28]LEE C S， JUNG Y-T， SOOYEON P， et al.Lysinibacillusxylanilyticussp. nov.， a xylan-degrading bacterium isolated from forest humus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2010， 60(2)： 281-286.

[29]WEON H-Y， ANANDHAM R， KIM B-Y， et al.Dyellasolisp. nov. andDyellaterraesp. nov.， isolated from soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2009， 59(7)： 1685-1690.

[30]JOHANSEN J E， BINNERUP S J， KROER N， et al.Luteibacterrhizovicinusgen. nov.， sp. nov.， a yellow-pigmented gammaproteobacterium isolated from the rhizosphere of barley (HordeumvulgareL.)[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2005， 55(6)： 2285-2291.

[31]LI J， YANG G， WU M， et al.Bacillushuizhouensissp. nov.， isolated from a paddy field soil[J]. Antonie van Leeuwenhoek， 2014， 106(2)： 357-363.

[32]PALMISANO M M， NAKAMURA L K， DUNCAN K E， et al.Bacillussonorensissp. nov.， a close relative ofBacilluslicheniformis， isolated from soil in the Sonoran Desert， Arizona[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2001， 51(5)： 1671-1679.

[34]KWON S-W， KIM B-Y， SONG J， et al.Sporosarcinakoreensissp. nov. andSporosarcinasolisp. nov.， isolated from soil in Korea[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2007， 57(8)： 1694-1698.

[35]TEN L N， BAEK S-H， IM W-T， et al.Bacilluspocheonensissp. nov.， a moderately halotolerant， aerobic bacterium isolated from soil of a ginseng field[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2007， 57(11)： 2532-2537.

[36]冉國華， 張志元. 植物內生細菌研究及其應用[J]. 海南大學學報(自然科學版)， 2004， 22(4)： 365-373.

[37]WILKINSON K G，DIXON K W，SIVASITHAMPARAM K， et al. Effect of IAA on symbiotic germination of an Australian orchid and its production by orchid-associated bacteria[J]. Plant and Soil， 1994， 159(2)： 291-295.

[38]郭斌， 吳曉磊， 錢易. 提高微生物可培養(yǎng)性的方法和措施[J]. 微生物學報， 2006， 46(3)： 504-507.

[39]BLOOMFIELD S F， STEWART G S， DODD C E， et al. The viable but non-culturable phenomenon explained?[J]. Microbiology， 1998， 144(1)： 1-3.