閻　華，王　會(huì)，于　博*，黃升謀，李云捷，吳進(jìn)菊，李玉奇(.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄陽 44053； .襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 44053)

甲醚菊酯是一種人工合成的高效擬除蟲菊酯類殺蟲和殺螨劑。該農(nóng)藥具有典型的觸殺和胃毒作用，無內(nèi)吸和熏蒸作用。其殺蟲譜廣，對(duì)絕大多數(shù)昆蟲和螨蟲具有良好的效果，殺滅時(shí)間短[1]。甲醚菊酯在土壤中不移動(dòng)，對(duì)環(huán)境影響相對(duì)較小，但是其殘效期較長，因此容易通過食物鏈進(jìn)入人體，造成人體組織的損傷[2]。該農(nóng)藥適用作物有香蕉、大麥、棉花、萵苣、茶、蘋果、甜瓜、大蔥等。在農(nóng)業(yè)上，甲醚菊酯防治對(duì)象主要是各種鱗翅目幼蟲、粉虱、蚜蟲、植食性葉螨[3]。由于甲醚菊酯農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，其殘留造成的環(huán)境污染和食品污染直接威脅到人體健康。

生物原位修復(fù)方法相對(duì)來說對(duì)殘留農(nóng)藥的清除是比較有效的，因此越來越受到研究人員的重視。分離獲取微生物產(chǎn)生的酶用于降解農(nóng)藥，具有較多優(yōu)點(diǎn)[3]：(1)農(nóng)藥降解速度快，效率高，即使農(nóng)藥的濃度比較低，酶也能進(jìn)行催化；(2)安全無毒副作用，其降解產(chǎn)物可以溶解于水體中流入大海并進(jìn)行光氧化作用；(3)農(nóng)藥降解酶通常比產(chǎn)生這類酶的微生物菌體更能耐受異常環(huán)境條件，具有更寬廣的溫度和pH值穩(wěn)定范圍；(4)具有比微生物更寬廣的降解譜，可以對(duì)具有相同基團(tuán)的農(nóng)藥進(jìn)行酶降解作用。由微生物發(fā)酵后制備的粗酶蛋白，通常含有多種雜蛋白及其他小分子物質(zhì)。將有活力的酶從粗酶中有效分離出來，并測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)，有利于酶的綜合開發(fā)利用。因而，本研究采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離得到對(duì)甲醚菊酯農(nóng)藥有降解作用的細(xì)菌菌株，然后采用DEAE-52和CM-52陰陽離子纖維素交換層析柱對(duì)該菌株中甲醚菊酯降解酶進(jìn)行了部分純化。獲得部分純化酶以后，通過SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析，確定該酶蛋白的分子質(zhì)量，并評(píng)價(jià)陰陽離子纖維素交換層析柱的純化效果。最后對(duì)該細(xì)菌菌株中甲醚菊酯降解酶的酶促反應(yīng)最適溫度、最適pH值及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究，為其應(yīng)用于農(nóng)藥污染物的原位降解奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試劑與培養(yǎng)基

SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、溴酚藍(lán)、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、三羥甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、瓊脂糖，均購自上海生工生物工程有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，購自日本Takara公司；20%甲醚菊酯乳油，購自浙江威爾達(dá)化工有限公司;甲醚菊酯標(biāo)樣，購自北京康林科技有限公司。富集培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制和滅菌方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2　儀器與設(shè)備

UV-362型紫外-可見分光光度計(jì)，購自日本日立公司；TV-200型振蕩型恒溫水浴鍋，購自上海一恒科學(xué)有限公司；DHZ-5型恒溫振蕩器，購自太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；中空纖維超濾膜管，購自廣州能淼環(huán)?？萍加邢薰?；BD-164蛋白電泳儀、電泳槽，購自美國Bio-Rad公司；HP6890氣相色譜儀，購自美國惠普公司。

1.3　菌株分離及鑒定

準(zhǔn)確稱取湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥10 g放入250 mL錐形瓶，然后添加100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基，最初設(shè)定甲醚菊酯質(zhì)量濃度為100 mg/L，錐形瓶置于30 ℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)7 d。然后轉(zhuǎn)接5 mL培養(yǎng)液至二次無機(jī)鹽培養(yǎng)基(設(shè)定甲醚菊酯200 mg/L)，在30 ℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)7 d，以此重復(fù)接種5次，設(shè)置100 mg/L的質(zhì)量濃度梯度，使最后無機(jī)鹽培養(yǎng)液中甲醚菊酯的質(zhì)量濃度為500 mg/L，從而獲得對(duì)甲醚菊酯有降解活力的菌株。而后將菌懸液制備成10-6稀釋液，在固體富集培養(yǎng)基上劃線涂布，30 ℃培養(yǎng)2 d，根據(jù)細(xì)菌生長的外觀形態(tài)和特征選取單菌落，反復(fù)劃線培養(yǎng)，最后將分離得到的菌株(XU-3)接種于固體富集培養(yǎng)基斜面，保存于4 ℃冰箱備用。

甲醚菊酯降解菌株的形態(tài)、生理生化特征鑒定方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]。降解菌株總DNA的制備方法參照文獻(xiàn)[3]，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物FT1(5′-TGAGTTTGATTATGGCTCAG-3′)和RK2(5′-GAGGTTACCTTGTGTCGACTT-3′)，采用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增降解菌的16S rDNA片段。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后利用DNA膠回收試劑盒收集純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，最后送到深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站，使用Blast軟件進(jìn)行16S rDNA序列同源性比較。

1.4　甲醚菊酯降解菌XU-3粗酶液的制備及其可溶性蛋白含量測(cè)定

甲醚菊酯降解菌XU-3粗酶液的制備參照文獻(xiàn)[6]開展?？扇苄缘鞍缀康臏y(cè)定參照文獻(xiàn)[7]，使用福林酚法。

1.5　甲醚菊酯農(nóng)藥含量和菌體酶活力測(cè)定

甲醚菊酯農(nóng)藥含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]，使用氣相色譜法。酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9]，酶活力單位(U)定義為每分鐘降解1 mg甲醚菊酯所需的酶量。

1.6　甲醚菊酯降解菌XU-3生長與降解酶活力的關(guān)系試驗(yàn)

采用添加50 mg/L甲醚菊酯作為唯一碳、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)XU-3菌株，在30 ℃、pH值7.0、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)120 h，每隔12 h測(cè)定XU-3菌液的OD600 nm[10]，同時(shí)按照1.5的方法測(cè)定培養(yǎng)基中殘留甲醚菊酯農(nóng)藥的含量，計(jì)算出菌體酶活力單位。

1.7　甲醚菊酯降解酶的部分純化

1.7.1DEAE-52陰離子交換層析使用1 mol/L的HCl溶液處理DEAE-52樹脂成Cl-型。用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液平衡DEAE-52柱子24 h后，加樣XU-3粗酶液20.0 mL，然后使用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，最后使用0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫。用自動(dòng)收集器收集流出液，自動(dòng)收集器設(shè)定為9 min/格，流速為9 滴/min。收集時(shí)間約9 h，得到XU-3酶蛋白的收集峰。按照1.5的方法測(cè)定出峰樣品的酶活力，將有活力的樣品合并后用透析膜和聚乙二醇-20000進(jìn)行濃縮。部分酶液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和酶活力測(cè)定，其余保存于4 ℃冰箱備用。

1.7.2CM-52陽離子交換層析使用1 mol/L的NaOH 溶液處理CM-52樹脂成Na+型。用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液平衡CM-52柱子24 h后，加樣濃縮過的XU-3酶液，然后使用0.005 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，最后使用0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫。用自動(dòng)收集器收集流出液，自動(dòng)收集器設(shè)定為9 min/格，流速為9 滴/min。收集時(shí)間約8 h，得到XU-3酶蛋白的收集峰。然后將有活力的收集峰合并濃縮，測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活力后，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8　酶蛋白純度鑒定及其分子質(zhì)量測(cè)定

酶蛋白的純度鑒定及其分子質(zhì)量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]開展，使用SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳法。電泳完成后，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶位置相比較，測(cè)算出甲醚菊酯降解酶蛋白的分子質(zhì)量。

1.9　甲醚菊酯降解酶特性研究

1.9.1酶促反應(yīng)最適溫度測(cè)定將純化后的甲醚菊酯降解酶配制成0.01 mg/mL的液體，分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴中保持60 min，然后根據(jù)1.5的方法測(cè)定酶活力，以酶活力最高值為基準(zhǔn)，測(cè)算出各溫度下的相對(duì)活力[11]，相對(duì)活力最高值所對(duì)應(yīng)的溫度即為酶促反應(yīng)最適溫度。

1.9.2酶促反應(yīng)最適pH值測(cè)定將純化后的甲醚菊酯降解酶配制成0.01 mg/mL的液體，用0.1 mol/L HCl或者NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，并保持60 min，然后按照1.5的方法測(cè)定酶活力，以酶活力最高值為基準(zhǔn)，測(cè)算出各pH值下的相對(duì)活力[12]，相對(duì)活力最高值所對(duì)應(yīng)的pH值即為酶促反應(yīng)最適pH值。

1.9.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定分別配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mmol/L的甲醚菊酯溶液，在最適條件下按照1.5的方法測(cè)定酶活力，以單位時(shí)間底物濃度[S]減少量計(jì)算出反應(yīng)速率V。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)算甲醚菊酯降解酶對(duì)底物的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。Lineweaver-Burk方程[11]如下所示：

2　結(jié)果與分析

2.1　甲醚菊酯降解菌XU-3菌落形態(tài)特征

采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離得到1株細(xì)菌XU-3，在30 ℃采用營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24 h后，可見其菌落形態(tài)為黃色、濕潤圓形略隆起、邊緣整齊，直徑2 mm左右。

2.2　甲醚菊酯降解菌XU-3生理生化特征及其16S rDNA鑒定結(jié)果

采用VITEK-32 全自動(dòng)微生物鑒定儀分析菌株XU-3的形態(tài)和生理生化特性，結(jié)果見表1。從表1可以看出，菌株XU-3屬于革蘭氏陰性菌，短桿狀，其生化反應(yīng)具有典型的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)特性。同時(shí)以菌株XU-3總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物FT1和RK2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為836 bp的16S rDNA基因片段。測(cè)序后將XU-3的16S rDNA序列與GenBank上其他細(xì)菌的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株的16S rDNA與陰溝腸桿菌BX273453.1菌株的同源性達(dá)98.0%。綜合菌株XU-3的形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株XU-3鑒定為陰溝腸桿菌。

表1　菌株XU-3的形態(tài)和生理生化特性

注：+代表陽性，-代表陰性。

2.3　甲醚菊酯降解菌XU-3生長與降解酶活力的關(guān)系

采用添加50 mg/L甲醚菊酯作唯一碳、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)陰溝腸桿菌XU-3，測(cè)定不同時(shí)間段菌株生長和甲醚菊酯降解酶活力的關(guān)系。由圖1可以看出，甲醚菊酯降解酶的活力大小變化和菌株XU-3生長速度基本一致，都在60 h達(dá)到最大值。因此，用于制備甲醚菊酯降解酶的培養(yǎng)時(shí)間選擇60 h較為合適。

圖1　菌株XU-3生長與甲醚菊酯降解酶活力的關(guān)系

2.4　甲醚菊酯降解酶的純化

2.4.1DEAE-52纖維素柱層析20.0 mL粗酶液經(jīng)過DEAE-52柱層析后，具有甲醚菊酯農(nóng)藥降解活力的酶蛋白出現(xiàn)在餾分管的第20～40管(圖2)。DEAE-52柱層析后酶蛋白得到初步純化，將獲得的第20～40 管酶蛋白使用透析膜和聚乙二醇-20000進(jìn)行除鹽和濃縮，共收集到濃縮后的酶液5.6 mL。

圖2　甲醚菊酯降解酶的DEAE-52纖維素柱層析結(jié)果

2.4.2CM-52纖維素柱層析5.6 mL DEAE-52濃縮后的酶液經(jīng)過CM-52柱層析后，具有甲醚菊酯農(nóng)藥降解活力的酶蛋白出現(xiàn)在餾分管的第25～45 管(圖3)。將第25～45 管的酶液使用透析膜和聚乙二醇-20000進(jìn)行除鹽和濃縮，共收集到濃縮后的酶液2.2 mL。

圖3　甲醚菊酯降解酶的CM-52纖維素柱層析結(jié)果

2.4.3部分純化結(jié)果分析陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶經(jīng)過部分純化的結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，最初陰溝腸桿菌XU-3中破碎得到的粗酶液總體積為20.0 mL，通過DEAE-52柱層析后，酶液總體積為5.6 mL，再通過CM-52柱層析后，酶液總體積為2.2 mL。甲醚菊酯降解酶經(jīng)過部分純化后，酶液的總體積降低，而其酶蛋白比活力上升，所以DEAE-52和CM-52柱層析對(duì)酶蛋白具有純化作用。最初酶的總蛋白質(zhì)量為12.4 mg，通過DEAE-52柱層析后，總蛋白質(zhì)量為2.6 mg，再通過CM-52柱層析后，總蛋白質(zhì)量為1.9 mg，酶蛋白得到了進(jìn)一步的純化。酶總活力最初為189.4 U，通過DEAE-52柱層析后，總活力為146.8 U，再通過CM-52柱層析后，總活力為126.5 U。這表明，酶的總活力隨著純化過程會(huì)逐漸降低，主要是純化過程中回收率降低的原因。而酶的比活力是升高的，最初酶的比活力為15.2 U/mg，通過DEAE-52柱層析后，酶的比活力上升為56.5 U/mg，再通過CM-52柱層析后，酶的比活力上升為66.6 U/mg。綜合計(jì)算后，純化倍數(shù)為4.4，回收率為66.8%，相對(duì)而言酶蛋白的回收率較高[7]。

表2　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶的純化結(jié)果

2.5　甲醚菊酯降解酶的電泳分析

將純化的甲醚菊酯降解酶進(jìn)行SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析，從圖4可以看出，甲醚菊酯降解酶出現(xiàn)較為清晰的條帶，該條帶較粗，考馬斯亮藍(lán)染色較深，表明經(jīng)過純化的酶較為均一，酶蛋白量較豐富。根據(jù)SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳的酶分子質(zhì)量計(jì)算方法，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的分子質(zhì)量約為74.8 ku。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker；1—2.甲醚菊酯降解酶圖4　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶的SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析

2.6　甲醚菊酯降解酶的特性

2.6.1酶促反應(yīng)最適溫度將甲醚菊酯降解純化酶在不同溫度保持60 min后，對(duì)其酶活力進(jìn)行了測(cè)定(圖5)。從圖5可以看出，酶促反應(yīng)最適溫度為35 ℃，該酶在25～40 ℃時(shí)活力較為穩(wěn)定，相對(duì)酶活力可以達(dá)到60%以上。溫度對(duì)酶活力的影響體現(xiàn)在兩方面[12]。一方面，酶促反應(yīng)速度隨溫度的升高而增加，主要原因是較高溫度有助于酶的分子構(gòu)象改變，更容易和底物相結(jié)合。本研究中，溫度從20 ℃上升到35 ℃時(shí)，酶活力明顯增加。另一方面，當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，由于酶蛋白出現(xiàn)變性，酶活力會(huì)逐漸降低甚至完全消失。本研究中，溫度從35 ℃上升到60 ℃時(shí)，酶活力下降明顯，60 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力僅為20%左右。綜合以上結(jié)果，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖5　不同溫度處理對(duì)甲醚菊酯降解酶活力的影響

2.6.2酶促反應(yīng)最適pH值酶液中pH值對(duì)酶活力的影響是多方面的[9]：可能改變酶蛋白分子構(gòu)象，進(jìn)而影響酶活力中心基團(tuán)，使酶活力發(fā)生改變；也可能改變酶的解離狀態(tài)，一般來說，只有特定解離狀態(tài)最適合酶促反應(yīng)。本研究將甲醚菊酯降解純化酶在不同pH值保持60 min后，對(duì)其酶活力進(jìn)行了測(cè)定(圖6)。從圖6可以看出，酶促反應(yīng)最適pH值為8.5，該酶在pH值7.5～9.0時(shí)活力較為穩(wěn)定，相對(duì)酶活力可以達(dá)到60%以上。由此可以推測(cè)，陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶是一種偏堿性水解酶，在偏堿性環(huán)境中可以發(fā)揮農(nóng)藥降解作用。當(dāng)pH值低于8.5時(shí)，酶活力隨pH值降低而降低，在pH值5.0時(shí)，相對(duì)酶活力僅為20%左右。當(dāng)pH值高于8.5時(shí)，酶活力隨pH值上升而降低，在pH值10.0時(shí)，相對(duì)酶活力不足25%。 綜合以上結(jié)果， 陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶的最適反應(yīng)pH值為8.5。

圖6　不同pH值處理對(duì)甲醚菊酯降解酶活力的影響

2.6.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對(duì)甲醚菊酯降解酶進(jìn)行了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定，以酶促反應(yīng)速度倒數(shù)1/V對(duì)底物濃度倒數(shù)1/[S]作圖，采用線性回歸方程來計(jì)算反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)。由圖7可以看出，甲醚菊酯降解酶對(duì)底物甲醚菊酯的降解作用符合米氏方程線性特征。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.994，表明線性擬合較好，可以用于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。通過線性回歸方程計(jì)算后得到，Km為0.825 mmol/L，Vmax為0.748 mmol/(L·min)。

圖7　菌株XU-3中甲醚菊酯降解酶對(duì)底物作用的Lineweaver-Burk曲線

3　結(jié)論與討論

本研究采用平板劃線培養(yǎng)的方法從湖北省襄陽市農(nóng)藥廠下水道活性污泥中分離獲得了對(duì)甲醚菊酯有降解作用的細(xì)菌菌株XU-3，經(jīng)過VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀分析，綜合其形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，將其鑒定為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。陰溝腸桿菌XU-3可以生長于甲醚菊酯農(nóng)藥作為唯一碳、氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，可以獲得最大量的甲醚菊酯降解酶，降解酶活力達(dá)到8.5 U/mL。隨后使用DEAE-52和CM-52陰陽離子交換層析柱對(duì)陰溝腸桿菌XU-3中甲醚菊酯降解酶進(jìn)行了部分純化，經(jīng)檢測(cè)分析，純化了4.4倍，酶活力回收率為66.8%。使用SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，純化酶的分子質(zhì)量約為74.8 ku，屬于小分子質(zhì)量酶蛋白，后續(xù)研究中可以對(duì)其進(jìn)行基因序列測(cè)定。本研究獲得純酶后，測(cè)定了酶促反應(yīng)最適溫度、最適pH值及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等基本性質(zhì)，有助于甲醚菊酯降解酶的實(shí)際應(yīng)用。測(cè)定結(jié)果表明，酶促反應(yīng)最適溫度為35 ℃，最適pH值為8.5，在溫度25～40 ℃和pH值7.5～9.0內(nèi)，甲醚菊酯降解酶具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，該范圍和農(nóng)藥廠下水道的環(huán)境相匹配。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定表明，該降解酶對(duì)底物甲醚菊酯農(nóng)藥的Km為0.825 mmol/L，Vmax為0.748 mmol/(L·min)，說明該酶對(duì)甲醚菊酯的降解屬于正向反應(yīng)，降解速度較快。研究該酶的純化特性也有助于更深入研究XU-3降解甲醚菊酯農(nóng)藥的機(jī)制，后續(xù)研究中可以探討其屬于水解作用、氧化作用還是礦化作用，并且可以研究其反應(yīng)產(chǎn)物。

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