王熙鳳，孟慶玲*，喬　軍，陳　英，鐘文強(qiáng)，貢莎莎，黃運(yùn)福，才學(xué)鵬(.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 83003； .中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

肝片吸蟲(chóng)(Fasciolahepatica，F(xiàn)h)屬于吸蟲(chóng)綱、片行科、片行屬的一種常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，中間宿主主要是椎實(shí)螺科的淡水螺。肝片吸蟲(chóng)病在全球具有廣泛的流行性[1-2]，在我國(guó)呈地方性流行，多發(fā)于夏秋兩季，內(nèi)蒙古、青海、甘肅、新疆等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的省(區(qū))發(fā)病較為嚴(yán)重，其中，羊的感染率一般為20%～60%，個(gè)別養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)可高達(dá)90%以上，發(fā)病率達(dá)10%～100%[3]，成為低洼、潮濕牧區(qū)羊場(chǎng)羊病死的重要原因之一。肝片吸蟲(chóng)可感染多種哺乳動(dòng)物宿主，特別是綿羊、山羊和牛，人也可以被感染，被感染后成蟲(chóng)主要寄生在肝臟、膽管內(nèi)，以食血為主[4]，可引起急性或者慢性肝炎和膽管炎。

近年來(lái)，隨著環(huán)境和氣候的變化，該病的流行率和發(fā)病率逐漸升高[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有2.5億～3.0億牛羊和240萬(wàn)～1 700萬(wàn)人感染肝片吸蟲(chóng)，給家畜生產(chǎn)和人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，可引發(fā)家畜肝損壞、消化道感染、急性腎損傷等并發(fā)癥，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)200萬(wàn)美元[6-10]。但由于動(dòng)物肝片吸蟲(chóng)感染初期無(wú)特征性臨床癥狀，很難確診，因此，建立該病感染的早期診斷方法具有重要的意義。

新疆是我國(guó)五大牧區(qū)之一，也是我國(guó)牛羊重要的養(yǎng)殖基地。然而，在新疆許多放牧地區(qū)，牛羊肝片吸蟲(chóng)病長(zhǎng)期流行，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)和牧民身體健康帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。因此，有效地防治該病對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。目前，肝片吸蟲(chóng)病主要依靠藥物防治，但易產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題。因此，研究高效、安全的防治肝片吸蟲(chóng)病的疫苗意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白樣蛋白(Ftn-1)具有作為肝片吸蟲(chóng)早期診斷抗原的潛力，是抗肝片吸蟲(chóng)病的候選抗原。鑒于此，本研究對(duì)肝片吸蟲(chóng)Ftn-1基因進(jìn)行克隆和分子特征分析，構(gòu)建了原核表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行抗原性分析，旨在篩選特異性高、反應(yīng)原性強(qiáng)的肝片吸蟲(chóng)診斷抗原。

1　材料和方法

1.1　菌株、質(zhì)粒及試劑

菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)、表達(dá)載體pET-32a(+)均由石河子大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和XhoI、DNA Marker、pMD19-T克隆載體、T4 DNA 連接酶、IPTG、PCR Mixture、蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自諾維森生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG、低背景化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；DAB顯色劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

綿羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清、羊肝片吸蟲(chóng)IgG抗體EISA檢測(cè)試劑盒均由沙灣獸醫(yī)站提供。

1.2　引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Ftn-1基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，分別在上、下游引物5′端加入2個(gè)保護(hù)性堿基以及EcoR I和XhoⅠ 限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，上游引物：5′-CGGAATTCATGCGTGGTGGAAAATT-3′ (EcoR Ⅰ)；下游引物：5′ -CCCTCGAGTCAATTCCATATGGGAGC-3′ (XhoⅠ)，引物由華大基因生物公司合成。

1.3　肝片吸蟲(chóng)總RNA的提取

肝片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)采自新疆烏魯木齊市活畜屠宰場(chǎng)綿羊的肝臟，蟲(chóng)體采回后用PBS緩沖液清洗3～5遍，剪蟲(chóng)體的1/3(約20 mg)，加入800 μL Trizol充分研磨，加200 μL氯仿靜置后吸取上清，加入500 μL異丙醇靜置離心后留下白色沉淀，沉淀中加入30 μL DEPC水，測(cè)定RNA濃度，于-80 ℃保存。

1.4　Ftn-1基因的RT-PCR擴(kuò)增

利用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增Ftn-1基因。將提取后的肝片吸蟲(chóng)總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行Ftn-1基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 10 μL，PCR Mixture 7 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為477 bp。

1.5　PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序與分子特征分析

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，將目的片段與pMD19-T克隆載體于4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)PCR和雙酶切進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，用在線軟件Expasy、BepiPred 1.0 Server、Predictprotein、Swiss-mode對(duì)測(cè)序結(jié)果及Ftn-1基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、抗原表位、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。

1.6　Ftn-1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將膠回收目的片段和原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別用EcoRⅠ和XhoⅠ 進(jìn)行雙酶切，回收雙酶切產(chǎn)物，與T4 DNA連接酶4 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR和雙酶切進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pET-Ftn-1。

1.7　重組蛋白Ftn-1的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-Ftn-1轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入液體1.0 mmol/L IPTG(終濃度)進(jìn)行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后8 h分別收集菌液，采用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白是否表達(dá)。

1.8　重組蛋白包涵體的純化

收集重組菌菌體，加入20 mL Lysis Buffer吹打混勻，反復(fù)凍融4次，用超聲波破碎45 min，至菌體不再黏稠為止。破碎后將菌體9 000 r/min，離心30 min棄去上清，沉淀中加入8 mol/L尿素16 mL，室溫過(guò)夜放置使沉淀溶解，經(jīng)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后用蛋白質(zhì)純化儀純化，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將純化后的蛋白質(zhì)在透析袋中分別置于8、6、4、2、1 mol/L尿素溶液中各透析6 h，透析后用蔗糖濃縮至終質(zhì)量濃度為1 g/L，放置在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9　重組蛋白Western blot 分析

將濃縮后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，用半干式轉(zhuǎn)移盒轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，用含5%脫脂奶粉的TBST[11]封閉1 h，TBST洗滌3次，加入綿羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清(1∶1 000稀釋)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌4次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(1∶3 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌3次后用DAB顯色，去離子水終止顯色。

1.10　重組蛋白Ftn-1 免疫原性檢測(cè)

取15只雌性小鼠，10只為試驗(yàn)組，5只為對(duì)照組。將純化后重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化混勻后，試驗(yàn)組每只小鼠皮下注射200 μL，間隔14 d后進(jìn)行第2次免疫，將弗氏完全佐劑更換成弗氏不完全佐劑，免疫14 d后心臟采血，靜置分離血清。用羊肝片吸蟲(chóng)IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫小鼠血清是否產(chǎn)生抗體。

2　結(jié)果與分析

2.1　Ftn-1基因的RT-PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約477 bp，與預(yù)期目的大小一致，證明成功克隆到了Ftn-1基因(圖1)。將克隆成功的Ftn-1基因轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性菌株，提質(zhì)粒后經(jīng)EcoR Ⅰ、XhoⅠ 雙酶切，得到1條約2 692 bp的載體片段和1條約477 bp的插入片段，表明pMD19-T克隆載體中成功插入了目的片段(圖2)。

M：DL2000 DNA Marker；1、2：Ftn-1基因圖1　Ftn-1基因RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

M：DL2000 DNA Marker；1、2：Ftn-1基因雙酶切3：未經(jīng)酶切的Ftn-1基因圖2　Ftn-1基因的雙酶切鑒定結(jié)果

2.2　Ftn-1基因測(cè)序結(jié)果及分子特征分析

測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)tn-1基因cDNA全長(zhǎng)477 bp，編碼158個(gè)氨基酸，與GenBank中已上傳的肝片吸蟲(chóng)Ftn-1基因同源性為98.74%，推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性為97.47%。在編碼的氨基酸序列中有4個(gè)氨基酸差異，分別在第9(Q-R)、55(V-I)、100(L-S)、106(K-R)位。軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)tn-1蛋白為親水性蛋白，無(wú)跨膜區(qū)和信號(hào)肽；其多肽抗原表位區(qū)集中在第33—57、83—87、113—146位；該蛋白含有2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(31—34、52—55位)、1個(gè)N-?；稽c(diǎn)(83—88位)、2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(49—51、148—150位)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(85—93位)(圖3)；二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)、無(wú)規(guī)卷曲(random coil)分別占53.2%、7.6%、39.2%；三級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)卷曲連接2個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊構(gòu)成“N”字形的空間結(jié)構(gòu)(圖4)。

Ftn-1基因引物序列(下劃線)；2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(斜體加粗)；1個(gè)N-?；稽c(diǎn)(雙下劃線)；2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(波浪線)；1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(陰影部分)；抗原表位集中區(qū)(虛線框)圖3　Ftn-1基因核苷酸序列及編碼氨基酸序列

圖4　Ftn-1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3　重組表達(dá)載體的鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET-Ftn-1經(jīng)EcoR Ⅰ、XhoⅠ 雙酶切，出現(xiàn)大小約5 900 bp的表達(dá)載體片段和約477 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明，已成功將目的基因插入到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中。

2.4　重組蛋白Ftn-1的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，分別誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在33.5 ku處均見(jiàn)到1條蛋白條帶，且與目的蛋白預(yù)測(cè)大小一致，而在超聲裂解上清的相同位置未見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白以包涵體形式存在。純化后重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可見(jiàn)到單一的目的條帶，透析后濃縮至終質(zhì)量濃度為1 g/L(圖6)。

M：DL5000 DNA Marker；1—4：重組質(zhì)粒pET-Ftn-1雙酶切；5：未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒pET-Ftn-1圖5　重組質(zhì)粒pET-Ftn-1雙酶切鑒定結(jié)果

M：蛋白質(zhì)Marker；1：pET-32a載體菌株IPTG誘導(dǎo)6 h；2—6：重組菌誘導(dǎo)0、2、4、6、8 h；7：純化后的Ftn-1重組蛋白圖6　Ftn-1重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果

2.5　重組蛋白Ftn-1的Western blot 分析結(jié)果

將純化的重組蛋白Ftn-1經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到NC膜上，以綿羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清為一抗，以HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG為二抗，經(jīng)顯色后在目的條帶處可見(jiàn)到單一的特異性條帶(圖7)，證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：重組蛋白Ftn-1上清液；2：重組蛋白Ftn-1沉淀圖7　重組蛋白Ftn-1的Western blot 檢測(cè)

2.6　重組蛋白免疫小鼠后血清檢測(cè)結(jié)果

重組蛋白免疫小鼠后獲得的血清用羊肝片吸蟲(chóng)IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組10只小鼠血清均為陽(yáng)性，對(duì)照組5只均為陰性，表明重組蛋白Ftn-1能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，具有較強(qiáng)的免疫原性。

3　結(jié)論與討論

目前，肝片吸蟲(chóng)病的診斷主要依賴于糞便中蟲(chóng)卵檢查和免疫學(xué)檢測(cè)方法。然而，蟲(chóng)體一般都在感染后2～3個(gè)月才能成熟排卵，因而蟲(chóng)卵檢查不適用于肝片吸蟲(chóng)病的早期診斷。常用的免疫學(xué)診斷方法有間接血凝試驗(yàn)(IHA)、ELISA、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-ELISA)等。然而，目前免疫學(xué)診斷所使用的肝片吸蟲(chóng)診斷抗原多為蟲(chóng)體粗提抗原，其特異性較差。張雪娟等[12]以肝片吸蟲(chóng)提純抗原為診斷液，該方法雖能檢出1～3周齡的病羊，敏感性較高，但特異性較低。

篩選和鑒定特異性高、敏感性強(qiáng)的肝片吸蟲(chóng)抗原是建立特異敏感的血清學(xué)診斷方法的前提。McNulty等[13]對(duì)綿羊肝片吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的全基因組進(jìn)行了測(cè)序，共預(yù)測(cè)出14 642個(gè)編碼基因，并預(yù)測(cè)分析了其中一些抗原基因。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝片吸蟲(chóng)一些重要抗原蛋白如鞘脂激活樣蛋白2(SAP-2)、組織蛋白酶L(CatL)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)[14-15]、血紅蛋白(Hb)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)等多個(gè)肝片吸蟲(chóng)蛋白進(jìn)行了免疫學(xué)特性研究。Kazantseva等[16]純化了肝片吸蟲(chóng)分泌代謝抗原Fas2蛋白，建立了檢測(cè)肝片吸蟲(chóng)特異性抗體IgM的間接ELISA法，用建立的方法對(duì)76份感染肝片吸蟲(chóng)人陽(yáng)性血清和24份感染其他寄生蟲(chóng)人血清及84份健康人血清樣品進(jìn)行了IgM抗體檢測(cè)，結(jié)果表明，F(xiàn)as2-ELISA檢測(cè)方法的敏感性為43.4%，特異性為100%，與其他寄生蟲(chóng)陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，提示分泌代謝抗原Fas2蛋白在肝片吸蟲(chóng)早期急性感染中具有一定的診斷價(jià)值。

Ftn-1蛋白是細(xì)胞內(nèi)維持鐵平衡的一種重要蛋白，具有吸收鐵的能力，在寄生蟲(chóng)的發(fā)育和成熟過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，并參與生化反應(yīng)[17-19]；經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，肝片吸蟲(chóng)Ftn-1蛋白中特殊螺旋E和F的存在可穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能[20]。Cabán-Hernández等[21]選擇肝片吸蟲(chóng)Ftn-1重組蛋白作為包被抗原，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)健康人和感染肝片吸蟲(chóng)人的血清，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。Espino等[22]通過(guò)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，肝片吸蟲(chóng)Ftn-1基因在成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵階段的表達(dá)量均顯著高于童蟲(chóng)和毛蚴階段，提示Ftn-1蛋白具有作為肝片吸蟲(chóng)診斷抗原的潛力。對(duì)肝片吸蟲(chóng)Ftn-1蛋白的分子特征及其免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究，并高效表達(dá)了Ftn-1重組蛋白。Western blot分析證實(shí)，F(xiàn)tn-1重組蛋白可被綿羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，且具有良好的免疫原性，提示該蛋白在肝片吸蟲(chóng)免疫學(xué)診斷和亞單位疫苗研發(fā)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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