黃璇瑩，黃啟紅，吳慶暉，彭焱輝，羅錦霞，林　晨

(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州　510070)

桃金娘，別名山捻子(拉丁學(xué)名Rhodomyrtus tomentosa )，屬灌木，高1～2 m；嫩枝有灰白色柔毛。葉對(duì)生，革質(zhì)，葉片橢圓形或倒卵形，長(zhǎng)3～8 cm，寬1～4 cm，先端圓或鈍，常微凹入，有時(shí)稍尖，基部闊楔形，上面初時(shí)有毛，以后變無毛，發(fā)亮，下面有灰色茸毛，離基三出脈，直達(dá)先端且相結(jié)合，邊脈離邊緣3～4 mm，中脈有側(cè)脈4～6對(duì)，網(wǎng)脈明顯；葉柄長(zhǎng)4～7 mm?；ㄓ虚L(zhǎng)梗，常單生，紫紅色，直徑2～4 cm；萼管倒卵形，長(zhǎng)6 mm，有灰茸毛，萼裂片5，近圓形，長(zhǎng)4～5 mm，宿存；花瓣5，倒卵，形，長(zhǎng)1.3～2 cm；雄蕊紅色，長(zhǎng)7～8 mm；子房下位，3室，花柱長(zhǎng)1 cm。漿果卵狀壺形，長(zhǎng)1.5～2 cm，寬1～1.5 cm，熟時(shí)紫黑色；種子每室2列?；ㄆ?～5月[1]。桃金娘果具有補(bǔ)血，滋養(yǎng)，安胎。用于貧血，病后體虛，神經(jīng)衰弱，耳鳴，遺精[2]。

桃金娘利用價(jià)值高，其根、葉、果實(shí)都能作為藥用，桃金娘的果實(shí)是一種優(yōu)質(zhì)的果酒資源，含有豐富的多糖，根含有酚類、鞣制等保健功效成分[3-6]。熊娟等[7]對(duì)桃金娘根中五環(huán)三萜類物質(zhì)做過分析，含有豐富的三萜類物質(zhì)。熊果酸作為典型的五環(huán)三萜類物質(zhì)，在通常的保健功效成分檢驗(yàn)中常作為五環(huán)三萜類物質(zhì)以熊果酸計(jì)，桃金娘油具備很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值，目前對(duì)桃金娘油中三萜類物質(zhì)研究資料較少，現(xiàn)對(duì)桃金娘果實(shí)中油脂的熊果酸含量進(jìn)行研究，為其提供更多保健功效做理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1　主要材料

桃金娘果實(shí)分別購于廣東肇慶、廣東韶關(guān)、廣西桂林、云南、江西、貴州，將購買的桃金娘果實(shí)洗凈、晾曬、粉碎、過篩后，在105℃烘干至恒重，干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品:中國(guó)食品檢定研究院，冰醋酸、香草醛、 高氯酸、石油醚、無水乙醇等均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

1.2　主要儀器

UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司，電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司，電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司，超聲波清洗器： Fisher Scientific，脂肪測(cè)定儀SOX406：濟(jì)南海能儀器股份有限公司，比色管。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　桃金娘果實(shí)中油脂的提取

取于干燥箱中干燥兩小時(shí)的桃金娘果實(shí)粉末，用定量濾紙包裹好置于索氏抽提儀中，于鋁杯中加入石油醚適量，設(shè)定提取溫度65℃，提取時(shí)間6 h，回收提取液揮干，得到桃金娘果油脂。

2.2　桃金娘果油脂中熊果酸的提取

準(zhǔn)確稱取桃金娘果油脂樣品0.1 g于100 mL容量瓶中，加入無水乙醇80 mL，超聲提取1 h。室溫冷卻后，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，作為供試液。

2.3　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱取0.01 g熊果酸對(duì)照品，置100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成約10 μg/mL的熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4　測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 mL于比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60 ℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL乙酸后，在可見光區(qū)進(jìn)行掃描，如圖1確定最大吸收波長(zhǎng)546 nm。

圖1　熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的光吸收曲線

2.5　顯色劑香草醛乙酸溶液用量的選擇

分別取0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液加入到6個(gè)比色管中，水浴蒸干，分別加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL乙酸后，在546 nm測(cè)定其吸光度值。

圖2　顯色劑用量對(duì)吸光度影響

由圖2比較得知，顯色劑用量在0.3mL時(shí)，吸光度最大，因此選擇0.3 mL香草醛溶液用量為顯色劑用量。

2.6　穩(wěn)定劑高氯酸用量的選擇

分別取0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液加入到8個(gè)比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL乙酸后，在546 nm測(cè)定其吸光度值。

圖3　穩(wěn)定劑用量對(duì)吸光度影響

由圖3比較得知，穩(wěn)定劑在1.2 mL時(shí)，吸光度最大，因此選擇高氯酸用量為1.2 mL作為穩(wěn)定劑用量。

2.7　水浴時(shí)間的選擇

分別取0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液加入到6個(gè)比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱5,10,15,20,25，30,35min，取出冷卻后加入5 mL乙酸后，在546 nm測(cè)定其吸光度值。

圖4　水浴時(shí)間對(duì)吸光度影響

由圖4比較得知，穩(wěn)定時(shí)間在25min時(shí)，吸光度最大，因此選擇25min為水浴時(shí)間。

2.8　水浴溫度的選擇

分別取0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液加入到7個(gè)比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，分別于50,55,60,65,70,75,80℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL乙酸后，在546 nm測(cè)定其吸光度值。

圖5　水浴溫度對(duì)吸光度影響

由圖5比較得知，吸光度隨著水浴溫度的升高而增大，但是同比溫度下做空白試驗(yàn)，結(jié)果顯示在水浴溫度高于60℃后顏色較深，吸光度較大，因此選擇60℃水浴溫度為較佳。

2.9　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

分別取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液到比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛乙酸溶液和1.2 mL高氯酸后，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻至室溫后加入5 mL乙酸，在546 nm測(cè)定吸光度。分析結(jié)果見表1。以質(zhì)量c為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合， c與A之間呈線性關(guān)系。線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)見表1，線性擬合曲線見圖6。該分析方法線性關(guān)系良好，可以進(jìn)行定量分析。

表1　熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)

圖6熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液線性擬合曲線

Fig.6Linear fitting curve of ursolic acid standard solution

2.10　精密性試驗(yàn)

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL高氯酸后，在546 nm下測(cè)定吸光度。以上操作分別在不同日期，不同人員，不同儀器的情況下分別測(cè)試兩次，計(jì)算六個(gè)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見表2，RSD=1.65%，精密性良好。

表2　測(cè)定方法的精密性

2.11　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL高氯酸后，分別穩(wěn)定10、20、30、40、50、60min后，在546 nm下測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)試樣在不同穩(wěn)定時(shí)間點(diǎn)的吸光度如表3，結(jié)果顯示在60min內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=1.1%，具有較好的穩(wěn)定性。

表3　測(cè)定方法的穩(wěn)定性

2.12　重復(fù)性試驗(yàn)

取6個(gè)配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 mL于10 mL比色管中，水浴蒸干，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.2 mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻后加入5 mL高氯酸后，在546 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算六個(gè)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4，RSD=0.9%,具有良好的重復(fù)性。

表4　測(cè)定方法的重復(fù)性

2.13　加標(biāo)回收率

稱取經(jīng)2.1處理的試樣液體0.1 g(精確到0.0001 g)，共稱取12個(gè)，每四個(gè)為一組一共三組，每組保留一個(gè)不加標(biāo)，另外三個(gè)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品稱取后，按2.2操作處理，于樣品中分別加入樣品含量的80%，100%，150%的熊果酸對(duì)照品，按2.9項(xiàng)下試驗(yàn)方法處理進(jìn)行比色測(cè)定，即進(jìn)行三組不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表5。從表5可知，此三組不同濃度的平均加標(biāo)回收率分別為98.8%、98.5%、98.9%，滿足一般檢測(cè)方法對(duì)回收率要求。

表5　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　樣品含量測(cè)定

分別取采自6個(gè)不同地方的桃金娘果實(shí)，按2.1操作計(jì)算出桃金娘果含油率，按2.2方法進(jìn)行供試夜制備，各取0.1 mL供試液于具塞比色管，水浴蒸干，加入0.3 mL5%香草醛乙酸溶液和1.2 mL高氯酸后，于60℃水浴加熱25min，取出冷卻至室溫后加入5 mL乙酸，在546 nm測(cè)定吸光度。通過線性回歸方程計(jì)算得到供試液中熊果酸的含量如表6。

表6　不同產(chǎn)地桃金娘果油脂中熊果酸的含量

4　結(jié)論

以香草醛乙酸溶液及高氯酸為顯色劑，并通過水浴加熱的條件，采用分光光度法測(cè)定桃金娘果油脂中熊果酸含量，并從準(zhǔn)確度和精密性兩方面對(duì)方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：該方法操作簡(jiǎn)單、精密性高、重復(fù)性好和回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

不同產(chǎn)地的桃金娘果實(shí)都含有豐富的三萜類化合物，其提取的油脂中熊果酸含量都在20%以上，實(shí)驗(yàn)方法的建立為桃金娘果實(shí)的保健功效開發(fā)利用提供了參考價(jià)值。

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