金君，李堅(jiān)，袁榮霞

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

近年來(lái)全世界每年約有近1 600萬(wàn)人死于肺癌［1］。大多數(shù)患者確診時(shí)已是局部晚期或晚期肺癌。順鉑作為晚期非小細(xì)胞肺癌聯(lián)合化療方案中的基本藥物，在臨床長(zhǎng)期使用過(guò)程中引起的腫瘤細(xì)胞耐藥性使其治療效果逐漸降低［2］。順鉑主要通過(guò)作用于DNA導(dǎo)致其形成鏈間交聯(lián)和鏈內(nèi)交聯(lián)，造成DNA損傷，由此干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鏈間交聯(lián)指DNA鏈間發(fā)生了錯(cuò)誤的共價(jià)交聯(lián)，是毒性最強(qiáng)的一種DNA損傷，如不及時(shí)修復(fù)，鏈間交聯(lián)會(huì)轉(zhuǎn)換成DNA雙鏈斷裂（DSB）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性與DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)。根據(jù)DNA損傷的類(lèi)型和位點(diǎn)，鏈間交聯(lián)損傷的修復(fù)方式可分為核苷酸切除修復(fù)、非同源末端連接、同源重組修復(fù)、跨損傷合成（translesion synthesis，TLS）修復(fù)和范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）通路等［3］。而與其他通路不同的是，TLS通路可通過(guò)復(fù)制性DNA聚合酶越過(guò)損傷的DNA位點(diǎn)繼續(xù)進(jìn)行DNA鏈復(fù)制來(lái)耐受DNA損傷［2－3］。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞獲得性耐藥與FA通路以及TLS通路等的再活化有關(guān)［2－4］。在鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)過(guò)程中，F(xiàn)A通路、TLS通路和其他信號(hào)通路交互作用，共同參與這種DNA損傷的修復(fù)。FA是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，絕大部分由FA相關(guān)基因失活引起。這種遺傳病會(huì)導(dǎo)致患者的體細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑類(lèi)化療藥物（如順鉑）異常敏感，并且使患者更易發(fā)生腫瘤和骨髓衰竭［5］。目前已經(jīng)證實(shí)FA通路由19個(gè)FA蛋白（FANCA-FANCNT）組成，其中任何一個(gè)蛋白的缺失都有可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)性損傷劑的高度敏感，這也構(gòu)成了抑制FA通路蛋白增加鉑類(lèi)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性的作用機(jī)制［6］。

RAD18作為一種E3泛素連接酶可與RAD6結(jié)合形成RAD6／RAD18復(fù)合體，通過(guò)誘導(dǎo)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的單泛素化和招募TLS聚合酶來(lái)激活TLS通路。RAD6／RAD18還可通過(guò)誘導(dǎo)FANCD2的單泛素化激活FA通路［7－8］。同時(shí)單泛素化的FANCD2亦可通過(guò)招募TLS聚合酶激活TLS通路。REV1屬于TLS聚合酶中的Y家族成員，在鏈間交聯(lián)和DSB損傷的修復(fù)中扮演了重要角色，具有為其他TLS聚合酶提供平臺(tái)的作用［9－10］。其他Y家族的DNA聚合酶通過(guò)REV1作用域與REV1相互作用，在DNA損傷耐受機(jī)制中行使功能。例如，DNA聚合酶η的一個(gè)PIP結(jié)構(gòu)域與REV1作用域重疊，可與REV1結(jié)合并激活下游蛋白［11］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默 A549／DDP細(xì)胞的FA通路和TLS通路的上游調(diào)節(jié)基因RAD18以及TLS通路的REV1基因后，觀察FANCD2及PCNA的單泛素化水平、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡率變化，探討抑制 RAD18和 REV1后逆轉(zhuǎn) A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的可行性及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

肺癌A549和A549／DDP細(xì)胞株（中科院上海生命科學(xué)研究院）；RMPI 1640培養(yǎng)液以及胎牛血清（以色列Bioind公司）；順鉑注射液（江蘇豪森制藥有限公司）；siRNA套裝：含RAD18與REV1的特異性siRNA及陰性對(duì)照siRNA（廣州銳博生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin V-FITC／PI流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒與PI／RNase細(xì)胞周期檢測(cè)試劑（美國(guó) BD公司）；RAD18和PCNA蛋白抗體（美國(guó) Cell Signaling公司）；REV1和 FANCD2蛋白抗體（美國(guó) Santa Cruz公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、PVDF膜、牛血清白蛋白和ECL發(fā)光劑（美國(guó)Millipore公司）。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

用含有0.1%青霉素與鏈霉素（雙抗）及10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549和A549／DDP細(xì)胞株，在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549／DDP細(xì)胞均勻接種于6孔板，使每孔密度相近，約為80%。過(guò)夜培養(yǎng)后用不含胎牛血清及雙抗的培養(yǎng)液（空白培養(yǎng)液）饑餓細(xì)胞2 h。取 siRNA儲(chǔ)存液2.5μL及 LipofectamineTM2000試劑5μL分別溶于250μL空白培養(yǎng)液中，室溫孵育5 min后，在20 min內(nèi)加入每孔含空白培養(yǎng)液1 mL的上述6孔板中。轉(zhuǎn)染6～8 h后，用只含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺癌細(xì)胞株中各蛋白的表達(dá)

提前1 d將A549和轉(zhuǎn)染前后的A549／DDP細(xì)胞株分別接種于6孔板中，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別加入含順鉑濃度梯度為 0、1.25、2.5、5、10和20μg／mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，先用預(yù)冷（4℃）1×PBS沖洗各孔3次，棄上清液，再每孔加入細(xì)胞裂解液90μL，用細(xì)胞刮板分別取出細(xì)胞裂解物于標(biāo)記的EP管中，干式恒溫器100℃煮沸5 min，細(xì)胞超聲破碎儀破碎30 s，常溫離心機(jī)2 000 r／min離心1 min后，置于－20℃冰箱保存。蛋白樣品行10%SDS-PAGE，根據(jù)蛋白分子量大小選擇轉(zhuǎn)膜90～120 min，后續(xù)用脫脂牛奶封閉1 h，相應(yīng)的一抗REV1羊抗人（1∶1 000）、RAD18（1∶1 000）、FANCD2（1∶1 000）和 PCNA（1∶1 000）兔抗人低溫（4℃）搖床孵育過(guò)夜，用TBST洗膜（15 min×3次），羊抗鼠 IgG（1∶10 000）和羊抗兔 IgG（1∶10 000）二抗孵育1 h，現(xiàn)配現(xiàn)用ECL發(fā)光劑，用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，Lane 1D凝膠分析軟件分析其灰度。每個(gè)蛋白的相對(duì)含量為蛋白的表達(dá)量與對(duì)應(yīng)的β-肌動(dòng)蛋白比值，F(xiàn)ANCD2單泛素化水平為FANCD2長(zhǎng)短片段之比即L／S，PCNA單泛素化水平為PCNA－mUb與PCNA的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4　CCK-8法檢測(cè)A549／DDP細(xì)胞的增殖率

將轉(zhuǎn)染前后的A549／DDP細(xì)胞株接種于96孔板，使每孔密度約為2×103個(gè)，同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在96孔板各孔中分別加入含順鉑濃度梯度為0、1.25、2.5、5、10和20μg／mL的 100μL培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和48 h，用空白培養(yǎng)液作為空白組進(jìn)行校正。每孔加入含10%CCK-8試劑的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀上檢測(cè)光密度（D）值。細(xì)胞增殖率＝［（實(shí)驗(yàn)組D平均值－空白組D平均值）／（陰性對(duì)照組D平均值－空白組D平均值）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549／DDP細(xì)胞的凋亡率

以6孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后的A549／DDP細(xì)胞，使其密度約為2×105／孔。加入含順鉑濃度為10μg／mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，用無(wú)EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，低溫離心機(jī)2 000 r／min離心10 min，用預(yù)冷（4℃）1×PBS重懸細(xì)胞，再次離心，倒盡上清液，取1×連接緩沖液500 mL輕柔緩慢稀釋成細(xì)胞懸液，加入流式管中，順序加入5μL的Annexin VFITC和5μL的PI染色液同時(shí)輕搖混勻，室溫避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率（發(fā)射波長(zhǎng)530 nm、激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6　流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期

6孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后的A549／DDP細(xì)胞，使各孔密度約為2×105／孔。每孔用10μg／mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞于流式管中，用3 mL PBS重懸細(xì)胞，1 500 r／min離心10 min后，棄上清液，逐滴加入預(yù)冷的75%乙醇5 mL，混勻細(xì)胞，4℃避光過(guò)夜且超過(guò)18 h。低溫離心機(jī)1 500 r／min離心10 min，用1×PBS清洗細(xì)胞兩次，棄上清液，每管加入500μL PI／RNase染色液，過(guò)200目篩網(wǎng)后再加入標(biāo)記好的流式管中，4℃避光保存，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數(shù)比較行SNK-q檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)比較行Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Bliss法計(jì)算肺癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（50 percent inhibitory concentration，IC50）。

2　結(jié)果

2.1　A549和 A549／DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后的RAD18、REV1蛋白表達(dá)水平

經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后，A549細(xì)胞的RAD18蛋白和REV1蛋白表達(dá)水平隨著順鉑濃度的升高而下降；而A549／DDP細(xì)胞的RAD18、REV1蛋白表達(dá)隨著順鉑濃度升高而升高；在順鉑濃度為0時(shí)，A549／DDP細(xì)胞組 RAD18蛋白表達(dá)水平與A549細(xì)胞組無(wú)明顯差異（t＝1.739，P＝0.097），在其他的順鉑濃度點(diǎn)耐藥細(xì)胞中這兩個(gè)蛋白的表達(dá)量均明顯高于 A549細(xì)胞（均 P＜0.05）。A549／DDP細(xì)胞中RAD18和REV1蛋白的表達(dá)上調(diào)表明FA通路和TLS通路功能增強(qiáng)，提示與該細(xì)胞株對(duì)順鉑耐藥有關(guān)。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1　A549和A549／DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑處理后RAD18蛋白的表達(dá)水平

圖2　A549和A549／DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑處理后REV1蛋白的表達(dá)

2.2　轉(zhuǎn)染 siRNA前后 A549／DDP細(xì)胞 REV1和RAD18蛋白的表達(dá)

A549／DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 REV1-siRNA和RAD18-siRNA后，REV1蛋白和RAD18蛋白表達(dá)水平均比陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯降低（均P＜0.05）；陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3和圖4。表明REV1-siRNA和RAD18-siRNA轉(zhuǎn)染有效。

圖3　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染REV1-siRNA后REV1蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖4　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后RAD18蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.3　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA前后FANCD2單泛素化水平

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后，經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后的 A549／DDP細(xì)胞FANCD2蛋白單泛素化水平較轉(zhuǎn)染前明顯降低（均P＜0.05）（圖5），表明沉默 RAD18基因后抑制了FANCD2的單泛素化，RAD18位于FA通路的上游，是調(diào)控FA通路重要因子。

2.4　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA前后 PCNA單泛素化水平

轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后，經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后A549／DDP細(xì)胞的PCNA單泛素化水平明顯降低（均 P＜0.05，圖6），表明 RAD18是參與 PCNA單泛素化調(diào)控的重要組分。RAD18和RAD6形成的RAD6／RAD18復(fù)合物可通過(guò)誘導(dǎo)PCNA單泛素化繼而激活TLS通路。沉默RAD18基因可使TLS通路的PCNA單泛素化水平明顯降低，表明RAD18不僅參與了FA通路的激活，也是TLS通路的調(diào)控因子。

圖5　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后FANCD2單泛素化水平

圖6　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后PCNA單泛素化水平

2.5　分別及共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA對(duì)A549／DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

2.5.1順鉑對(duì)轉(zhuǎn)染不同siRNAs的 A549／DDP細(xì)胞增殖的抑制作用 A549／DDP細(xì)胞分別和共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA，經(jīng)順鉑處理24 h和48 h后的IC50較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均明顯降低 （均P＜0.05），共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 IC50較單轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA或REV1-siRNA細(xì)胞進(jìn)一步下降（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。圖7和圖8顯示，隨著順鉑濃度的增高，單轉(zhuǎn)染組與共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率逐漸降低，且呈劑量依賴(lài)性，共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率下降較單轉(zhuǎn)染組更為明顯（均P＜0.05），而兩個(gè)單轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異（P＞0.05）。隨著順鉑作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖率繼續(xù)降低，呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。這些結(jié)果表明沉默RAD18和REV1基因可明顯增加順鉑耐藥肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，這兩個(gè)基因共沉默則可進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

表1　轉(zhuǎn)染不同siRNAs后A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50 μg／mL

圖7　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)順鉑處理24 h的增殖率

圖8　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)順鉑處理48 h的增殖率

2.5.2轉(zhuǎn)染不同siRNAs后 A549／DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑誘導(dǎo)的凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，A549／DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA以及兩者共轉(zhuǎn)染后，早期凋亡率分別為（24.60±2.11）%、（23.33±3.13）%和（40.55±1.01）%，均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的早期凋亡率 （12.62±1.75）% （均 P＜0.05）。兩個(gè)單轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞早期凋亡率無(wú)明顯差異（t＝0.583，P＞0.05），但共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于兩個(gè)單轉(zhuǎn)染組（均 P＜0.05）。見(jiàn)圖9。

圖9　A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)10μg／m L順鉑處理48 h的凋亡率

2.5.3A549／DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同 siRNAs后順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期變化 分別和共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA以及 REV1-siRNA后，A549／DDP細(xì)胞經(jīng)10μg／mL順鉑處理48 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞數(shù)比例較未轉(zhuǎn)染組明顯增加（均P＜0.05），且共轉(zhuǎn)染組比單轉(zhuǎn)染組增加更為明顯（均P＜0.05）。表明轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和（或）REV1-siRNA后，A549／DDP細(xì)胞主要阻滯于G2期。見(jiàn)圖10。

圖10　各組A549／DDP細(xì)胞經(jīng)10μg／m L順鉑處理48 h的細(xì)胞周期

3　討論

順鉑主要是通過(guò)抑制DNA的復(fù)制殺傷腫瘤細(xì)胞，順鉑引起的DNA損傷類(lèi)型包括鏈間交聯(lián)、DSBs、單鏈斷裂和染色體重排［12］。相關(guān)研究表明腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力是順鉑耐藥的主要原因之一，而順鉑耐藥是一個(gè)涉及多個(gè)DNA損傷修復(fù)通路的復(fù)雜過(guò)程［13］。因此，探明腫瘤細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)這些DNA損傷而具備的多種DNA修復(fù)機(jī)制是解決順鉑耐藥的前提。

腫瘤細(xì)胞通過(guò)DNA損傷反應(yīng)機(jī)制不斷檢查染色體DNA是否存在受損或被阻滯的DNA復(fù)制叉。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA交聯(lián)損傷時(shí)，可激活經(jīng)典的FA通路產(chǎn)生修復(fù)反應(yīng)，首先該通路的8個(gè)上游FA蛋白以及FA相關(guān)蛋白被活化形成FA核心復(fù)合物，然后單泛素化FANCD2和FANCI，再形成復(fù)合物ID，定位于受損的DNA，繼而募集并激活FA通路的下游蛋白到DNA損傷部位，經(jīng)過(guò)與其他DNA修復(fù)通路蛋白的相互作用，修復(fù)損傷DNA［14］。有文獻(xiàn)報(bào)告，當(dāng)細(xì)胞DNA交聯(lián)損傷發(fā)生時(shí)，除了FA核心復(fù)合物可以引起FANCD2的單泛素化，RAD18和RAD6形成的復(fù)合物也參與觸發(fā)FA通路的這一關(guān)鍵步驟［15］。FANCD2單泛素化是FA通路激活過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，也是FA通路被激活的標(biāo)志。FANCD2單泛素化水平反映了FA通路的激活狀態(tài)。研究顯示應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)直接下調(diào)FANCD2或者下調(diào)FA通路上游的蛋白表達(dá)，可以抑制FANCD2單泛素化，通過(guò)阻滯FA通路激活，抑制化療藥物誘導(dǎo)DNA損傷的修復(fù)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［16－18］。本研究應(yīng)用 siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲減RAD18基因?qū)е翭ANCD2的單泛素化水平明顯下降，并顯示出順鉑對(duì)耐藥肺癌細(xì)胞A549／DDP的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯增加，以及細(xì)胞周期S／G2阻滯效應(yīng)增強(qiáng)，證明RAD18作用于FA通路上游，直接參與調(diào)控和誘導(dǎo)FANCD2的單泛素化以及FA通路的激活，參與了DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)。

DNA修復(fù)通路模型表明，致DNA損傷因子作用于細(xì)胞后導(dǎo)致DNA復(fù)制叉停滯、雙螺旋解開(kāi)并產(chǎn)生異常的單鏈DNA。這些DNA單鏈未復(fù)制的區(qū)域被異常的單鏈DNA結(jié)合蛋白即復(fù)制蛋白A包被，繼而招募RAD18到DNA損傷位點(diǎn)，啟動(dòng)TLS通路等參與的復(fù)制后修復(fù)［3］。RAD6與 RAD18結(jié)合后形成的RAD6／RAD18主要通過(guò)誘導(dǎo)PCNA單泛素化而激活TLS，促使特異性DNA聚合酶在DNA損傷部位募集，觸發(fā) TLS通路的 DNA修復(fù)反應(yīng)［19］。作為T(mén)LS聚合酶Y家族重要成員的REV1具有特殊的BRCT結(jié)構(gòu)域，能與PCNA結(jié)合并發(fā)生相互作用［20］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A核心復(fù)合物對(duì)REV1的募集也有調(diào)控效應(yīng)，提示FA通路和TLS通路之間有著密切的相互作用［21］。本實(shí)驗(yàn)沉默RAD18基因后顯示PCNA蛋白的單泛素化水平明顯下調(diào)，表明RAD18在TLS通路被激活的PCNA單泛素化過(guò)程中發(fā)揮了不可或缺的作用。

本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞的毒性作用明顯低于A549細(xì)胞，而順鉑誘導(dǎo)的A549／DDP細(xì)胞REV1和RAD18蛋白表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞，順鉑可誘導(dǎo) A549／DDP細(xì)胞的 FANCD2和PCNA單泛素化水平呈劑量依賴(lài)性升高，提示FA通路與TLS通路均參與了A549／DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑誘導(dǎo)DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)，或者說(shuō)參與了A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染敲減RAD18基因下調(diào)其蛋白表達(dá)后可明顯抑制FANCD2和PCNA單泛素化水平，與此同時(shí)能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)A549／DDP的細(xì)胞毒性，表明RAD18在FA和TLS兩個(gè)通路參與的順鉑所致DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了作用［22］。此外，本研究中細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減REV1基因亦能明顯增加順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，證實(shí)REV1在TLS通路參與的順鉑誘導(dǎo)的DNA交聯(lián)損傷修復(fù)中具有重要作用。值得注意的是，RAD18和REV1基因共沉默后增加順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞毒性的作用強(qiáng)于分別單獨(dú)沉默RAD18和REV1基因，提示雖然RAD18在FA和TLS兩個(gè)通路中參與DNA修復(fù)過(guò)程，與REV1共同作用在TLS通路，但RAD18和REV1的DNA修復(fù)功能并不完全重疊在一個(gè)相同的DNA修復(fù)通路中。此外，RAD18或REV1亦可能通過(guò)FA和TLS通路之外的其他途徑或機(jī)制，參與DAN交聯(lián)損傷的修復(fù)，導(dǎo)致共沉默A549／DDP細(xì)胞的這兩個(gè)基因?qū)樸K的致敏效應(yīng)強(qiáng)于單基因沉默。RAD18和REV1在DNA交聯(lián)損傷修復(fù)過(guò)程中可能存在的不同作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示，F(xiàn)A通路和TLS通路在順鉑所致肺癌細(xì)胞DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)中發(fā)揮了重要作用，這兩個(gè)通路功能上調(diào)是肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的主要機(jī)制之一。分別抑制這兩個(gè)通路中的RAD18和REV1蛋白均可增加順鉑對(duì) A549／DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而共抑制RAD18和REV1可進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，顯示出對(duì)順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。我們的研究結(jié)果為今后應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)或小分子抑制劑抑制RAD18和REV1，逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，提高肺癌化療效果提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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