潘杰，吳玉梅，*，趙琪，趙蘭靜，吳茵，朱菊平，黃學(xué)文

（1.華東療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，江蘇無(wú)錫214065；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇無(wú)錫214023）

游離 DNA（free circulating／cell-free DNA，cfDNA）是一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的、片段化的胞外DNA，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中。目前cfDNA在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)和腫瘤的液態(tài)活檢方面應(yīng)用較廣。除此之外，cfDNA在器官移植、腦卒中、自身免疫病和心肌梗死等疾病上的應(yīng)用價(jià)值也日益清晰［1－3］。目前，對(duì)cfDNA提取質(zhì)量缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［4－5］。cfDNA在血漿內(nèi)的含量極低，大致范圍在15～40 ng／mL，在如此低豐度的情況下，采用紫外波長(zhǎng)等傳統(tǒng)方法得到的定量結(jié)果往往不準(zhǔn)確［6－8］。因此，如何正確評(píng)價(jià)cfDNA的提取質(zhì)量是急需解決的問(wèn)題之一。目前硅膠膜吸附柱提取方法是cfDNA提取量最大最純的一種方法，市場(chǎng)上最主要的產(chǎn)品為Qiagen公司的QIAamp游離核酸提取試劑盒（Qiagen CNA kit），其在cfDNA提取領(lǐng)域具有非常大的壟斷性。本研究將從cfDNA的提取效率、cfDNA的片段分布以及不同片段DNA的回收率等方面評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)cfDNA提取試劑盒的性能，以期掌握更好更經(jīng)濟(jì)的cfDNA提取方法。

1　材料與方法

1.1　對(duì)象

選取200例2016年10月20日來(lái)華東療養(yǎng)院體檢的人員作為志愿者，平均年齡42.6歲（35～55歲）。全部志愿者乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物和丙型肝炎病毒血清抗體均為陰性，肝腎功能、血脂和尿酸等生化指標(biāo)正常，超聲波檢查證實(shí)肝、膽、脾、胰、腎無(wú)異常，X線、CT及內(nèi)窺鏡檢查均正常。

1.2　方法

1.2.1血漿池A的制備 所有志愿者均于體檢時(shí)空腹抽取靜脈血4 mL，加入含EDTA的BD抗凝管中。1 900×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿至新1.5 mL EP管中，16 000×g離心10 min。吸取上清液，將所有上清液混合構(gòu)成血漿池A，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2cfDNA提取 用 Qiagen CNA kit和游離DNA大量提取試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司），按照說(shuō)明書(shū)分別提取1、2、3和5 mL血漿池A中的cfDNA 3次。4 mL血漿池每天提取2次，10 d共提取20次。提取物－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3cfDNA濃度檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道，血漿中的β-球蛋白基因濃度可以代表血漿中cfDNA濃度，因此用102 bp的β-球蛋白基因片段的熒光定量PCR的Ct值代表cfDNA濃度。用TaqMan qPCR體系（TaKaRa公司）在熒光定量PCR儀上（ABI ViiATM7DX熒光定量PCR儀）檢測(cè)血漿池A提取物中β-球蛋白基因含量。具體步驟：2×PCR緩沖液12.5μL，10μmol／L的 β-球蛋白基因上下游引物各0.5μL，10μmol／L的 TaqMan-BHQ1探針0.75μL，50×ROX液 0.25μL，DEPC水 0.5μL，提取物 10 μL，總體積25μL。擴(kuò)增條件為95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。β-球蛋白基因的上、下游引物及TaqMan-BHQ1探針由上海英駿公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.2.4PCR分析 cfDNA片段 在 ABIVERITI梯度PCR儀上，用普通PCR體系（江蘇昱安生物科技有限公司）分別擴(kuò)增4 mL血漿池A提取物中102和268 bp的β-球蛋白基因片段以及402和1 204 bp的p53基因片段。具體步驟：2×PCR緩沖液12.5 μL，10μmol／L的上下游引物各 0.5μL，提取物 5 μL，DEPC水6.5μL，總體積 25μL。擴(kuò)增條件：94℃ 1 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。上下游引物由上海英駿公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1　引物及探針序列

1.2.5PCR產(chǎn)物純化及定量 用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司）分別純化102、268和402 bp的PCR產(chǎn)物，核酸測(cè)定儀分別測(cè)定濃度。各取50μL純化后的102、268和402 bp片段混合，核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度。

1.2.6血漿池B1－B4的制備 在0.94 mL血漿池A中分別加入60μL已知濃度的片段長(zhǎng)度為102、268和402 bp的純化后的PCR產(chǎn)物及其混合物，形成1 mL血漿池B1－B4。

1.2.7血漿池B1－B4中不同DNA片段的回收率計(jì)算 用Qiagen CNA kit和游離DNA大量提取試劑盒（江蘇昱安生物科技有限公司），按照說(shuō)明書(shū)分別提取1 mL血漿池B1－B4中的cfDNA，每個(gè)血漿池每天重復(fù)提取cfDNA 2次，10 d共提取20次。以1 mL血漿池 A的提取物調(diào)零，核酸測(cè)定儀（NV3000C，VASTECH公司）分別測(cè)定核酸濃度，計(jì)算回收率，回收率＝回收后所獲得DNA量／回收前加入的DNA量。同時(shí)，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察回收效果。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；血漿用量與cfDNA的Ct值關(guān)系分析采用線性相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　兩種試劑盒提取的血漿池A中cfDNA濃度比較

熒光定量PCR結(jié)果表明，4 mL血漿池A血漿中，Qiagen和國(guó)產(chǎn)提取物中cfDNA含量的平均Ct值分別為27.94±0.423和27.41±0.356，兩種方法的Ct值差異明顯（t＝4.29，P＜0.01）。Qiagen和國(guó)產(chǎn)提取物中 cfDNA含量的 CV值分別為1.51%和1.30%。

2.2　兩種試劑盒提取的血漿池A中cfDNA片段分析

PCR結(jié)果表明，兩種方法的提取物在102、268和402 bp處均出現(xiàn)明顯條帶，而1 204 bp片段未出現(xiàn)。電泳結(jié)果還表明，國(guó)產(chǎn)試劑在102、268和402 bp處的條帶強(qiáng)度明顯高于Qiagen產(chǎn)品（圖1）。

圖1　血漿游離DNA片段長(zhǎng)度分析結(jié)果

2.3　血漿池B1－B4中不同片段DNA的回收率比較

結(jié)果見(jiàn)表2，兩者在102 bp和268 bp片段的回收率上差異顯著（t＝5.69，P＜0.01；t＝3.44，P＜0.01），而在402 bp及混合物的回收率上無(wú)明顯差異（t＝0.47，P＞0.05；t＝1.39，P＞0.05）。Qiagen CNA kit和國(guó)產(chǎn)試劑盒回收率的平均CV值為6.28%和6.09%。同時(shí)，電泳結(jié)果進(jìn)一步證明了不同片段DNA的回收效果（圖2、圖3）。

表2　兩種試劑對(duì)血漿池B1－B4中不同DNA片段回收率的比較

圖2　國(guó)產(chǎn)提取試劑不同DNA片段回收前后電泳結(jié)果

圖3　兩種提取試劑不同DNA片段回收后電泳結(jié)果比較

2.4　血漿用量與cfDNA的Ct值關(guān)系分析

1、2、3、4和5 mL血漿池A血漿中提取的cfDNA定量分析結(jié)果表明，Qiagen和國(guó)產(chǎn)試劑盒的血漿用量與Ct值存在負(fù)相關(guān)，線性方程式分別為Y＝－0.468X＋29.85，r2＝0.979（P＜0.01）；Y＝－0.432X＋29.35，r2＝0.963（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4　兩種試劑上樣量與cfDNA的Ct值的關(guān)系

3　討論

cfDNA正在成為產(chǎn)前檢測(cè)、癌癥診斷和監(jiān)測(cè)的重要臨床分析物。因?yàn)楂@得相對(duì)容易及無(wú)創(chuàng)性特點(diǎn)，cfDNA作為“液體組織”已經(jīng)顯示出了非常重要的臨床應(yīng)用前景［1－3］。目前，妨礙cfDNA成為一種強(qiáng)大的臨床分析物的主要因素之一就是提取物缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制。最近，在影響分析效果的樣品前處理和儲(chǔ)存等方面取得了進(jìn)展［9－11］，但提取方法和定量方法仍然是實(shí)驗(yàn)誤差的主要來(lái)源［4］。cfDNA在血漿（血清）中含量非常低，一般只有15～40 ng／mL，其提取質(zhì)量對(duì)分析方法的敏感性至關(guān)重要。因此，需要質(zhì)量控制來(lái)測(cè)量提取效率、片段大小以及提取物對(duì)下游檢測(cè)的影響。研究表明，不同方法提取效率可能有很大差異［5－7］。文獻(xiàn)報(bào)道Qiagen CNA kit是目前市場(chǎng)上最好的cfDNA提取方法之一［8］，我們通過(guò)與Qiagen試劑盒的比較，評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)cfDNA提取試劑盒的性能。

血漿cfDNA的片段長(zhǎng)度多集中在100～400 bp，基本無(wú)大于1 000 bp的cfDNA片段，而腫瘤來(lái)源的 cfDNA主要集中在 200～400 bp之間［12－13］，胎兒cfDNA通常比母體 cfDNA片段更小［14］。因此，cfDNA片段大小分析是評(píng)價(jià)cfDNA提取試劑盒的關(guān)鍵，所有方法提取的cfDNA必須體現(xiàn)血漿中cfDNA高度片段化的特征［15－16］。本研究對(duì)國(guó)產(chǎn)試劑盒進(jìn)行cfDNA片段大小的分析結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)試劑提取的cfDNA在102、268和402 bp處均出現(xiàn)明顯條帶，而1 204 bp片段未出現(xiàn)，結(jié)果與血漿中cfDNA高度片段化的特征相一致。且國(guó)產(chǎn)試劑在102、268和402 bp處的條帶強(qiáng)度明顯高于Qiagen產(chǎn)品，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)試劑盒在提取效率上可能高于Qiagen產(chǎn)品。

在許多cfDNA研究中使用的提取方法，最初被開(kāi)發(fā)主要是用于從血細(xì)胞或病毒粒子中提取高度完整的基因組DNA，而不是高度片段化的cfDNA。因此，不同提取方法可能對(duì)不同片段DNA具有不同的提取效果。為了評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)試劑盒對(duì)小片段DNA的提取效果，本研究在血漿池A加入固定濃度不同長(zhǎng)度的DNA片段，觀察國(guó)產(chǎn)試劑對(duì)不同長(zhǎng)度DNA片段的提取效率。結(jié)果表明，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的Qiagen CNA kit的cfDNA回收率約為90%相一致［10］。同時(shí)，國(guó)產(chǎn)試劑盒在短片段的提取效率上要優(yōu)于Qiagen CNA kit，而在稍大片段的DNA提取效率上與Qiagen CNA kit無(wú)異。另外，cfDNA提取的穩(wěn)定性和重復(fù)性也是評(píng)價(jià)試劑盒優(yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，Qiagen CNA kit的平均 CV值小于10%，其他一些試劑盒的平均CV值可能高達(dá)50%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Qiagen CNA kit的平均CV值為6.28%，國(guó)產(chǎn)試劑的平均CV值為6.09%。說(shuō)明國(guó)產(chǎn)試劑盒同樣具有很高的提取穩(wěn)定性和重復(fù)性。

除了提取回收效率之外，cfDNA總量分析也十分重要。cfDNA的總量變化在胎兒非整倍體分析［17］和癌癥相關(guān)拷貝數(shù)變化中應(yīng)用廣泛［6］。為了定量分析cfDNA的濃度，我們用熒光定量PCR方法分析了提取物中cfDNA濃度。結(jié)果表明，4 mL血漿池A國(guó)產(chǎn)和Qiagen的提取物中β-球蛋白基因的Ct值分別為27.41±0.356和27.94±0.423，兩種方法的Ct值差異明顯。國(guó)產(chǎn)和Qiagen的提取物中β-球蛋白基因Ct值的CV值分別為1.30%和1.51%。結(jié)果進(jìn)一步證明國(guó)產(chǎn)試劑在提取效率和提取穩(wěn)定上均有很好的效果。

cfDNA提取血漿用量通常為1 mL，為了監(jiān)測(cè)提取效率和提取產(chǎn)率的線性，我們分析了不同血漿用量與cfDNA濃度的關(guān)系。結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)試劑盒與Qiagen的上樣量與Ct值均存在負(fù)相關(guān)，血漿用量增加，總cfDNA產(chǎn)量增加，在5 mL范圍內(nèi)血漿用量與cfDNA產(chǎn)量呈線性關(guān)系。

綜上所述，本研究建立了一種評(píng)價(jià)cfDNA提取優(yōu)劣的方法，為選擇cfDNA提取試劑盒提供了依據(jù)；研究同時(shí)表明，國(guó)產(chǎn)cfDNA提取方法在各項(xiàng)評(píng)價(jià)性能上均可與Qiagen產(chǎn)品媲美。

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