郭慧，李曉燕，李東波，韓錦華

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院耳鼻喉科，大連 116021)

喉癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，具有快速生長(zhǎng)、強(qiáng)侵襲力的特點(diǎn)，常用治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，后二者在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也經(jīng)常會(huì)損傷正常細(xì)胞，光動(dòng)力療法是隨著激光醫(yī)學(xué)、光纖技術(shù)發(fā)展而日漸興起的針對(duì)腫瘤有效的治療方法，可選擇性的殺傷癌癥細(xì)胞而較少損傷正常組織的方法[1]。光敏劑是引起光動(dòng)力發(fā)生的重要因素之一。姜黃素不僅本身可以產(chǎn)生抗癌作用[2]，而且還被發(fā)現(xiàn)具有光敏劑的作用，具有高效、安全、少副作用、反復(fù)使用和成本相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于光動(dòng)力治療中[3]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是細(xì)胞質(zhì)中酪氨酸磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)通路中的一種雙功能蛋白，在腫瘤組織（包括喉癌）內(nèi)高表達(dá)，被認(rèn)為是一種原癌基因[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)激光照射姜黃素，了解其對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞系增殖、凋亡及STAT3傳導(dǎo)通路調(diào)控蛋白p-STAT3、cyclin Dl和Bcl-2水平的影響，為進(jìn)一步了解姜黃素抗癌作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑、抗體與細(xì)胞株

人鱗狀喉癌細(xì)胞株Hep-2（本實(shí)驗(yàn)室保存），RPMI1640培養(yǎng)基，濃縮型磷酸化STAT3兔抗人單克隆抗體（p-STAT3，針對(duì)705位酪氨酸磷酸化位點(diǎn)）和B淋巴細(xì)胞2（Bcl-2）鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司），cyclin D1蛋白多克隆抗體購(gòu)自北京賽弛生物科技有限公司，姜黃素購(gòu)自Sigma公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

人喉癌Hep-2細(xì)胞株置于37.0℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含10%小牛血清、1%青霉素及鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組（既不加光敏劑也不照光，A組），光對(duì)照組（不加光敏劑的單純照光對(duì)照組，B組），光敏劑對(duì)照組（只加光敏劑不照光的光敏劑對(duì)照組，C組），光敏劑處理組（同時(shí)光敏劑和照光，D組）。

3 細(xì)胞的光敏劑處理

將培養(yǎng)的人喉癌細(xì)胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化、吹打，制成單細(xì)胞懸液。分別接種于96孔和6孔培養(yǎng)板上，置于37.0℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，嚴(yán)格避光條件下，加濃度為5μmol/L光敏劑，在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育8h，然后照光。

4 細(xì)胞的照光處理

用波長(zhǎng)為445nm的激光進(jìn)行照射，光斑直徑為1.0cm，通過(guò)光導(dǎo)纖維使激光均勻垂直地照射到細(xì)胞培養(yǎng)板（6孔板用于細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，96孔板用于細(xì)胞增殖檢測(cè)），監(jiān)測(cè)照射前后激光輸出功率的變化，控制其變化幅度＜5%，光照的功率密度為50mW/cm2，照射時(shí)間為2min，光照能量為100J/cm2，照光時(shí)注意不照光的孔應(yīng)避光。

5 細(xì)胞增殖的MTT法檢測(cè)

上述經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療的細(xì)胞，加入5g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入甲臜200μl，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm各孔吸光度A值，并按照公式（增殖抑制率=[（對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值]×100%，抑制率﹥30%，即對(duì)該藥敏感性高）計(jì)算抑制率。

6 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

上述4組經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療的喉癌細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液， PBS處理，在70%冰乙醇中固定，37℃水浴1h，加入10%雞血紅細(xì)胞作為內(nèi)參，與樣本同步染色，加入碘化丙啶（PI）染液，4℃避光染色30min，然后流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定（美國(guó)Beckman Coulter公司，Epics-XL Ⅱ型） ，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，630nm帶通濾光片接收，利用前散射光/側(cè)散射光散點(diǎn)圖收集細(xì)胞共10000個(gè)，排除細(xì)胞碎片和拈連細(xì)胞，得出并分析PI熒光直方圖上面凋亡細(xì)胞比例。

7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平

經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療后，用胰酶消化各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，然后將細(xì)胞制成混懸液，無(wú)血清狀態(tài)下繼續(xù)培育細(xì)胞16～24h， PBS處理，固定于4%多聚甲醛中，冰浴避光40min，離心5min，倒掉上清；PBS清洗，離心，4%多聚甲醛常溫固定；然后用1ml（5%血清+0.2% Trion-X 100）培養(yǎng)液重懸，繼續(xù)冰浴、離心，p-STAT3、cyclin Dl、Bcl-2鼠單克隆抗體冰浴10min后，離心、清洗，繼而分別加入對(duì)應(yīng)的FITC標(biāo)記的二抗；避光冰浴、清洗、離心，重懸細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以熒光指數(shù)（FI）表示蛋白的相對(duì)含量。FI=樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度（樣品的均道值/對(duì)照組的均道值）；均道值=log（x-mode）值×340，如果FI＞1.0為陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel軟件處理，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較實(shí)行單因素方差變量分析，組間兩兩比較采用Dunnett T 3（方差不齊）或LSD- t檢驗(yàn)（方差齊），P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 光動(dòng)力治療后Hep-2細(xì)胞形態(tài)的觀察

空白對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞貼壁狀況良好，細(xì)胞透明，呈棱形或多角形，細(xì)胞伸展性良好，細(xì)胞膜清楚，細(xì)胞質(zhì)均勻、核大、核仁清楚；而光動(dòng)力治療組細(xì)胞貼壁情況欠佳明顯，細(xì)胞皺縮、形態(tài)不規(guī)則，胞核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞數(shù)目減少，懸浮細(xì)胞數(shù)增加。另外二組細(xì)胞略有皺縮改變、細(xì)胞數(shù)目減少（圖1）。

圖1 光動(dòng)力治療后Hep-2細(xì)胞的形態(tài)變化。A，A組(既不加光敏劑又不照光的空白對(duì)照組)；B，B組（不加光敏劑的單純照光對(duì)照組）；C， C組（只加光敏劑不照光的光敏劑對(duì)照組）；D，D組（光敏劑處理實(shí)驗(yàn)組）；比例尺，50μmFig. 1 Morphological changes of hep-2 cells after photodynamic therapy. A, group A received no light and photosensitizer as blank control; B, group B were exposed to light but no photosensitizer as light control; C, group C were treated with photosensitizer but no light exposure as photosensitizer control; D, group D received both light and photosensitizer; scale bar, 50μm

2 光動(dòng)力處理抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

MTT法檢測(cè)顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）可顯著抑制喉癌細(xì)胞增殖，抑制率分別為（41.35±4.12）%和（45.14±5.78）%，顯著高于空白對(duì)照組（A組）的（4.89±2.14）%；而同時(shí)光敏劑和照光（D組）可進(jìn)一步抑制喉癌細(xì)胞增殖，抑制率高達(dá)（65.12±5.89）%，顯著高于B組和C組（表1）。

表1 光動(dòng)力處理對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率（IR）和凋亡率（AR）影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.1 Statistical analysis for the effect of photodynamic therapy on the inhibitory rate (IR) of proliferation and apoptosis rate(AR) in Hep-2 cells

3 光動(dòng)力處理促進(jìn)細(xì)胞凋亡

碘化丙啶（PI）流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）可顯著增加喉癌細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為（24.56±1.89）%和（26.69±2.36）%，顯著高于空白對(duì)照組（A組）的（21.56±2.67）%；而同時(shí)光敏劑和照光（D組）可進(jìn)一步增加喉癌細(xì)胞凋亡，凋亡率高達(dá)（50.12±2.38）%，顯著高于B組和C組（表1）。

4 光動(dòng)力照射下調(diào)STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平

免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STAT3信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）中p-STAT3、Bcl-2和cyclin D1水平較空白對(duì)照（A組）降低，而同時(shí)光敏劑和照光（D組）p-STAT3、Bcl-2和cyclin D1水平進(jìn)一步降低，不僅低于A組，還明顯低于B組和C組（表2）。

表2光動(dòng)力照射對(duì)喉癌細(xì)胞P-SRAT3, Bcl-2, cyclin D1水平影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.2 Statistical analysis for the effect of photodynamic therapy on the levels of p-SRAT3, Bcl-2, and cyclin D1 in hep-2 cells

討 論

光動(dòng)力學(xué)療法（Photodynamic therapy，PDT）是上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的腫瘤治療的新方法[7]。該方法將光敏劑（photosensitizer）通過(guò)靜脈注射入人體后，有限時(shí)間內(nèi)光敏劑可以在癌組織中蓄積，使用特定波長(zhǎng)激光照射癌組織，可以直接激活癌組織內(nèi)的光敏劑分子，引起光化學(xué)反應(yīng)，生成強(qiáng)活性的單態(tài)氧，單態(tài)氧和生物大分子產(chǎn)生氧化反應(yīng)，利用細(xì)胞毒作用達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[8]。光敏劑是光動(dòng)力發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，激活后的光敏劑還可以破壞腫瘤組織內(nèi)的微血管，使腫瘤組織產(chǎn)生缺血性壞死。因?yàn)榻M織中光敏劑半衰期不同，所以光敏劑在正常細(xì)胞可以快速代謝，在癌組織內(nèi)可以蓄積，所以其只針對(duì)癌組織起作用。激活后的光敏劑既可以使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)等轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及生物學(xué)行為的變化[9]，又可以利用壞死、凋亡、自嗜等手段殺死腫瘤細(xì)胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素本身具有光敏劑的特性，將姜黃素溶于二甲基亞砜中，然后分別使用熒光分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)姜黃素的熒光發(fā)射光譜、吸收光譜、激發(fā)光譜，發(fā)現(xiàn)姜黃素在200～230nm和410～450nm處各有一吸收峰，其熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為530nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為425nm[11]。相對(duì)于血卟啉類(lèi)光敏劑姜黃素不僅能在腫瘤組織中聚積，而且全身清除率較快，減少了患者避光時(shí)間和光敏反應(yīng)。

在我國(guó)頭頸部惡性腫瘤中鼻咽癌、喉癌較為常見(jiàn)，該處的腫瘤常通過(guò)手術(shù)、放化療等手段控制，但由于頭頸部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手術(shù)切除易引起容貌的毀損或組織器官功能喪失，放療有時(shí)會(huì)發(fā)生難逆轉(zhuǎn)、難治愈且預(yù)后較差的放射性腦病，尤其是對(duì)首次治療失敗、局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期患者這些傳統(tǒng)的治療方法難以取得理想的療效。而光動(dòng)力學(xué)療法，對(duì)淺表性癌前期病變和早期癌腫，尤其是彌散性病變效果良好；對(duì)于深入的、進(jìn)展期癌腫，特別適用于不能耐受手術(shù)、禁忌放化療或治療失敗的患者，包括耳、鼻、咽、喉、消化道等處的癌腫，可明顯地改善患者病癥，提高生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期。

在胞外信號(hào)的刺激下STAT3發(fā)生磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于特定的DNA啟動(dòng)子序列上，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期控制基因c-Myc、cyclin D1和抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-xl、survivin和以及誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等重要基因的異常表達(dá)，表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖、血管形成、阻礙細(xì)胞凋亡等致癌作用［1-3］。

正常細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖是利用有絲分裂，即細(xì)胞難逆轉(zhuǎn)的進(jìn)入至終末分化階段進(jìn)行調(diào)控， STAT3可以調(diào)控cyclin D1基因，高表達(dá)cyclin D1基因可以促使細(xì)胞周期前進(jìn)，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。STAT3的持續(xù)高活性可以引起抑凋亡基因Bcl-xl的高表達(dá)，抑制STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)可以抑制細(xì)胞中Bcl-xl的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到當(dāng)含有藥物姜黃素的Hep-2細(xì)胞被激光照射后，喉癌細(xì)胞抑制率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯增加，p-STAT3蛋白表達(dá)與活性下調(diào)，影響了STAT3傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白cyclin Dl、Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制喉癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，推測(cè)其原因之一是姜黃素可以直接引起細(xì)胞死亡，另外被激發(fā)后的姜黃素作為光敏劑也可以抑制p-STAT3 、cyclin Dl、Bcl-2表達(dá)從而起到作用。本實(shí)驗(yàn)從驗(yàn)證了姜黃素作為光敏劑的對(duì)喉癌的治療作用，為頭頸部鱗癌患者的綜合治療提供了新的理論依據(jù)。

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