孫 毅 譚 博 蘇瑞斌

抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，神經(jīng)精神藥理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京，100850，中國

嗎啡等阿片類藥物是目前臨床上最常使用的一類鎮(zhèn)痛藥［1］，此類藥物在治療疼痛的同時也伴有耐受、胃腸功能紊亂、呼吸抑制等副作用。除此之外，阿片類物質(zhì)在使用過程中誘導(dǎo)欣快感和易成癮的特點(diǎn)使得該類藥物在毒品市場上大量非法流通，給無數(shù)家庭和社會帶來巨大危害［2］。在這些副作用中，呼吸抑制是限制阿片類藥物用藥安全性的主要原因［3］。過去幾十年里，因阿片類藥物濫用引起呼吸抑制而死亡的人數(shù)一直在上升，且預(yù)計短期內(nèi)人數(shù)仍將居高不下［4-5］。因此，自19世紀(jì)以來，人們就一直致力于設(shè)計、優(yōu)化阿片類藥物結(jié)構(gòu)，希望得到副作用更低而安全性更高的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥。

阿片的應(yīng)用已有幾千年歷史，但人們對其主要作用靶標(biāo)阿片受體（opioid receptor，OR）的認(rèn)識卻相對滯后。阿片受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR），主要可分為μ、δ、κ阿片受體和痛敏肽受體（孤兒受體）四種亞型［6］。最初，人們寄希望于受體亞型特異性配體以規(guī)避阿片類藥物常見的副作用，在這一理念的指導(dǎo)下，人們合成了新型化合物美沙酮、芬太尼等，也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了各個亞型的特異性內(nèi)源阿片肽［7-8］，但其副作用的問題依然沒有得到解決。至90年代，隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)嗎啡所有可觀察到的效應(yīng)在μ阿片受體（μ-opioid receptor，μOR）敲除的模式生物上都消失了，這提示無論是鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效應(yīng)還是呼吸抑制、胃腸功能紊亂、成癮等副作用都主要通過μOR［9］，受體亞型選擇性理論難以解釋這一現(xiàn)象。

近年研究發(fā)現(xiàn)，GPCR激活后，在其下游除了經(jīng)典的G蛋白依賴型信號通路外，還存在另一條由arrestin介導(dǎo)的平行的信號通路，不同的配體可以不同程度地激活這兩條通路，甚至只激活其中一條。因此，最終表現(xiàn)在整體動物上的藥理效應(yīng)也不同（Fig.1）［10］。有關(guān)μOR的研究進(jìn)一步顯示，阿片類藥物產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、欣快感以及軀體依賴主要由G蛋白依賴型信號通路介導(dǎo)，而其致耐受、胃腸功能紊亂、呼吸抑制等副作用則由β-arrestin依賴型信號通路介導(dǎo)［11］。如果某個配體偏向性激活G蛋白信號通路，那么該配體可能在保持鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜活性的同時，副作用相對于經(jīng)典的阿片類藥物大大降低?？梢哉f，arrestin依賴型信號通路的發(fā)現(xiàn)以及偏向性配體理論的提出給設(shè)計新型副作用降低的阿片類鎮(zhèn)痛藥提供了思路。

Fig.1 G protein-dependent and β-arrestin-dependent signaling through μOR

1　β-arrestin在阿片受體下游信號通路中的功能

Arrestin是GPCR下游信號通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的arrestin主要有四種，分別被命名為arrestin1～4，其中arrestin1和arrestin4存在于視網(wǎng)膜干體和錐體細(xì)胞上，主要結(jié)合視紫紅質(zhì)蛋白；而arrestin2和arrestin3廣泛分布于全身，也分別被稱為β-arrestin1和β-arrestin2［12］。Oakley根據(jù)受體與arrestin相互作用的特點(diǎn)將GPCR分為A、B兩類，其中A類GPCR僅結(jié)合β-arrestin，且與β-arrestin2結(jié)合的緊密程度要大于β-arrestin1；B類GPCR與β-arrestin1和β-arrestin2的親和力相近，同時也可以與arrestin1和arrestin4結(jié)合。除此之外，A類GPCR與arrestin的結(jié)合是瞬時的，而B類GPCR與arrestin的結(jié)合則較為穩(wěn)定，在這一分類下，阿片受體屬于A類GPCR［13］。

1.1　β-arrestin是GPCR下游G蛋白依賴型信號通路的抑制蛋白

上世紀(jì)90年代以前，人們對μ阿片受體下游G蛋白介導(dǎo)的信號通路就有所了解。與經(jīng)典的GPCR信號通路一致，當(dāng)激動劑作用于μ阿片受體后，受體偶聯(lián)G蛋白，G蛋白隨即被激活分解為Gα亞基和Gβγ亞基復(fù)合物，其后這兩種信號分子繼續(xù)作用于腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）、磷 脂 酶 C（phospholipase C，PLC）和K+、Ca2+離子通道，從而引起下游信號分子的變化［14］。Arrestin最初被認(rèn)為是終結(jié)這一反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，當(dāng)GPCR被G蛋白激酶（G-protein-coupled receptor kinase，GRK）磷酸化之后，受體C末端開始招募arrestin，arrestin與受體結(jié)合占據(jù)的位置在空間上阻礙了G蛋白與受體的相互作用，因此G蛋白依賴型信號通路被阻斷，這可能是受體脫敏的主要原因［15］。

1.2　β-arrestin作為銜接蛋白參與受體內(nèi)吞和泛素化

此后，一系列研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin在許多GPCR（包括μOR在內(nèi)）的內(nèi)吞和泛素化中起到了重要作用［16-17］。

β-arrestin被受體招募后，可作為銜接蛋白連接受體至網(wǎng)格蛋白包被小窩（clathrin-coated pits）中［18］。在這一過程中，β-arrestin至少直接與兩個內(nèi)吞相關(guān)分子作用，一個就是網(wǎng)格蛋白（clathrin），另一個是異四聚體網(wǎng)格銜接蛋白AP-2。當(dāng)受體C末端被GRK磷酸化之后，β-arrestin結(jié)合受體，之后招募網(wǎng)格蛋白和AP-2，致使細(xì)胞膜上的受體-β-arrestin復(fù)合物進(jìn)入小窩中。然后，受體內(nèi)吞至酸性核內(nèi)體，在酸性核內(nèi)體中的受體一部分去磷酸化后回收至細(xì)胞膜，而另一部分被降解，即受體下調(diào)［19］。因此，β-arrestin作為銜接蛋白參與了受體內(nèi)吞的過程。

除此之外，β-arrestin還作為E3連接酶銜接蛋白參與受體泛素化，這一現(xiàn)象最初是在β2腎上腺素受體中發(fā)現(xiàn)［20］。進(jìn)一步的研究表明β-arrestin是作為E3泛素連接酶 NEDD4（neural precursor cell expressed，developmentally downregulated 4，NEDD4）的支架蛋白促使受體泛素化［21］。

1.3　β-arrestin作為GPCR下游信號傳導(dǎo)器

以往研究結(jié)果使人們對β-arrestin的認(rèn)識停留在G蛋白信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子上，近幾年的最新研究成果顯示β-arrestin還可以作為GPCR的信號傳導(dǎo)器，獨(dú)立于G蛋白介導(dǎo)下游信號通路的傳遞。

β-arrestin被發(fā)現(xiàn)可以作為信號傳導(dǎo)器最初的證據(jù)是其可以作為支架蛋白將酪氨酸激酶c-Src（Src kinase）家族招募至GPCR上，而Src激酶家族不僅參與細(xì)胞的增殖與分化，也是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào) 節(jié) 激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路上的重要組成部分［22］。這一發(fā)現(xiàn)讓人們意識到GPCR下游不僅只有G蛋白介導(dǎo)的信號通路，還存在一條與G蛋白通路平行的β-arrestin依賴型信號通路［23］。此后，結(jié)果表明β-arrestin作為支架蛋白參與兩條信號通路，一條是上述MAPK/ERK通路，另一條是c-JUN氨基末端激酶3（c-JUN N-terminal kinase type 3，JNK3）通路［24-25］。β-arrestin作為支架蛋白組裝了通路中相互作用的蛋白，確保信號正確、特異地傳遞［26］。目前，對GPCR下游β-arrestin依賴型信號通路還知之甚少，唯一能確定的就是β-arrestin的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出當(dāng)前的認(rèn)知。

2　偏向性配體理論的提出與發(fā)展

以往，人們曾認(rèn)為配體發(fā)揮不同的藥理效應(yīng)是因為其作用的受體不同，而受體只有“開”或“關(guān)”兩種狀態(tài)分別對應(yīng)“有”或“無”兩種生理反應(yīng)［26］。80年代末期，人們開始意識到配體發(fā)揮藥理效應(yīng)并不完全取決于其作用的受體，而是和受體下游的信號分子相關(guān)［27］。90年代，研究證明了在相同的細(xì)胞環(huán)境下，配體作用于同一受體，并不是平均地激活下游每一條通路，而是對不同信號通路的激動活性不同［28］。因此，配體與受體的相互作用就不能用簡單的“開”“關(guān)”模式形容。隨著GPCR結(jié)構(gòu)解析研究的進(jìn)展，人們認(rèn)為受體的激活構(gòu)象是動態(tài)的、可變的，與不同配體結(jié)合，受體呈現(xiàn)出不同的激動態(tài)結(jié)構(gòu)，從而不同程度地招募G蛋白和β-arrestin，觸發(fā)不同的信號通路，最終引起千差萬別的效應(yīng)［29-30］。之后，人們發(fā)現(xiàn)某些配體偏向性地激活受體后某條信號通路，而較少或不激活受體后的其它通路，由此 “偏向性配體”的概念被逐漸提出，即配體并不是平均地激活GPCR下游的每一條信號通路，而是可能選擇性、偏向性地激活某些信號通路，這種現(xiàn)象也稱為“偏向性激活”［31］。

β-arrestin依賴型信號通路發(fā)現(xiàn)后，人們又很快發(fā)現(xiàn)G蛋白依賴型信號通路與β-arrestin依賴型信號通路對激動劑誘導(dǎo)的藥理作用的貢獻(xiàn)是不同的。有趣的是，對于μOR來說，G蛋白依賴型信號通路介導(dǎo)鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效應(yīng)，而β-arrestin依賴型信號通路則主要介導(dǎo)其他藥理效應(yīng)［32］。

近年來許多研究采用基因敲除的方法探討了β-arrestin與阿片類鎮(zhèn)痛藥的藥理效應(yīng)之間的關(guān)系。β-arrestin1和β-arrestin2完全敲除后有胚胎致死性，敲除小鼠無法成活，而單獨(dú)敲除β-arrestin1或β-arrestin2，則可以得到表型正常的小鼠，提示β-arrestin是小鼠生長發(fā)育過程中的必要蛋白，而β-arrestin1和β-arrestin2之間的功能可能相互替代［33-35］。對于β-arrestin1敲除小鼠，單劑量的嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)和野生型小鼠類似［36］；而在β-arrestin2敲除小鼠中，嗎啡表現(xiàn)出了更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，受體脫敏也明顯減弱［33-35，37］。采用 RNA 干擾敲低β-arrestin的小鼠和大鼠中也觀察到了類似的現(xiàn)象［38］。除鎮(zhèn)痛效應(yīng)外，還有研究表明嗎啡引起的便秘和呼吸抑制在β-arrestin2敲除小鼠中相對于野生型小鼠也明顯減弱。然而，并不是所有的阿片類藥物在β-arrestin2敲除小鼠上都表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效應(yīng)增強(qiáng)，美沙酮、芬太尼和埃托啡在β-arrestin2敲除小鼠上的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與野生型小鼠類似［36-37］。最新研究對芬太尼等阿片激動劑在分子水平進(jìn)行偏倚系數(shù)測定，同時在整體動物水平對這些藥物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)和呼吸抑制副反應(yīng)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示配體激活信號通路的偏倚和配體安全窗口大小有關(guān)。當(dāng)配體偏向性激活β-arrestin依賴型信號通路時，配體安全窗口較窄［39］。

以上實(shí)驗結(jié)果提示阿片類藥物引起的便秘、呼吸抑制等副反應(yīng)可能主要由β-arrestin2介導(dǎo)。如果能夠設(shè)計出只激活G蛋白依賴型信號通路的偏向性配體，那么該配體可能在保持其鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜活性的同時，其他藥理效應(yīng)（副作用）相對于經(jīng)典的阿片類藥物會大大降低。

目前研究認(rèn)為配體與受體結(jié)合，不同結(jié)構(gòu)的配體使受體處在不同的穩(wěn)定構(gòu)象中，導(dǎo)致下游信號傳遞分子結(jié)合或激活的差異，從而產(chǎn)生不同的信號，最終體現(xiàn)在動物水平上的藥理效應(yīng)也不一樣［30］。部分受體結(jié)構(gòu)解析研究提示受體中的某些基元（比如NPxxY）可能和β-arrestin的結(jié)合有關(guān)［40］，而某些基元（比如DRY和PIF）可能和G蛋白信號通路相關(guān)［11］。然而，受體介導(dǎo)偏向性信號通路的機(jī)制目前還不清楚。

3　基于偏向性配體理論設(shè)計的藥物

偏向性配體理論提示μ阿片受體下游G蛋白依賴型信號通路的偏向性激動劑可能在保持鎮(zhèn)痛活性的同時，較少引起便秘、呼吸抑制等副作用?？茖W(xué)家們基于這一理論廣泛設(shè)計篩選化合物，得到了一系列潛在的偏向性配體，其中較為成功的化合物主要有TRV130和PZM21。

3.1　TRV130

為了找到μ阿片受體G蛋白通路偏向性配體，科學(xué)家對現(xiàn)有化學(xué)庫中的大量化合物分別進(jìn)行G蛋白信號通路和β-arrestin信號通路活性的測定，初篩出一系列表現(xiàn)出G蛋白信號通路偏向性的化合物。在比較、分析這些化合物構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，從效能、偏向性、選擇性等方面對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了不斷優(yōu)化，最終得到了TRV130。在細(xì)胞實(shí)驗上，研究者發(fā)現(xiàn)TRV130相對嗎啡而言是β-arrestin偏向性激動劑，在小鼠和大鼠實(shí)驗上，TRV130較同等劑量下的嗎啡顯示出相似的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但胃腸功能紊亂和呼吸抑制等副作用則明顯減弱［41］。2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration）批準(zhǔn)TRV130進(jìn)入三期臨床研究，結(jié)果顯示Oliceridine（TRV130商品名）起效比嗎啡快，用藥后嘔吐現(xiàn)象減少，但只有最低劑量的Oliceridine所致的呼吸抑制作用比嗎啡更輕微，同時只有最高劑量的Oliceridine的鎮(zhèn)痛作用比嗎啡更強(qiáng)［42］。

3.2　PZM21

相對于TRV130從大量化合物的構(gòu)效關(guān)系研究入手，PZM21的設(shè)計策略則是基于對μOR的結(jié)構(gòu)分析。在已解析μOR結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將300萬個化合物與μOR的正性結(jié)合口袋進(jìn)行對接研究，從親和力排在前2 500名的化合物中找出23個結(jié)構(gòu)新穎且與受體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)D1473.32作用的化合物。將這23個化合物進(jìn)行活性和偏向性檢測，從中選出了一個強(qiáng)烈激活G蛋白依賴型信號通路而較少引起β-arrestin募集的化合物，對這個化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，最終得到了PZM21。相對于TRV130，PZM21在細(xì)胞水平上對μOR表現(xiàn)出了更高的亞型選擇性。動物實(shí)驗上，與等劑量的嗎啡相比，PZM21顯示出更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，而其誘導(dǎo)呼吸抑制和便秘的作用明顯降低［43］。以上結(jié)果均提示PZM21可能會成為一個非常值得期待的新型鎮(zhèn)痛藥。

4　展望

歷史上，人們?yōu)榱私鉀Q阿片類鎮(zhèn)痛藥的副作用問題，做了很多嘗試，比如設(shè)計阿片受體亞型選擇性激動劑［8］、設(shè)計正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑［44］等，但到目前為止尚不能有效地解決其多種副作用。β-arrestin依賴型信號通路的發(fā)現(xiàn)以及偏向性配體理論的提出給設(shè)計新型副作用更低的強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛藥提供了新的思路。這一新思路引起了廣泛的關(guān)注，但最終轉(zhuǎn)化成臨床可用的副作用降低的鎮(zhèn)痛藥還面臨許多挑戰(zhàn)。一方面，盡管我們從動物敲除實(shí)驗了解到G蛋白依賴型信號通路和β-arrestin依賴型信號通路分別介導(dǎo)性質(zhì)不同的藥理效應(yīng)，但G蛋白或β-arrestin下游的具體信號通路與最終藥理效應(yīng)的對應(yīng)關(guān)系目前還不清楚。另一方面，我們對受體和配體相互作用的結(jié)構(gòu)機(jī)制還不完全了解，配體具有什么樣的特點(diǎn)能被受體識別并偏向性激活某一條信號通路？配體微小結(jié)構(gòu)的差異如何引起受體結(jié)構(gòu)的變化，最終引起不同信號通路的傳遞？這些問題還沒有答案。除了以上這兩方面，如何測定、評估配體的偏向性目前仍存在爭議［45］。值得期待的是，受體后信號通路的偏倚現(xiàn)象普遍存在于所有的GPCR中，偏向性配體理論不僅有可能解決阿片類藥物副作用的問題，還可能為靶向其他GPCR的藥物設(shè)計提供思路，科研工作者可以根據(jù)實(shí)際需求自主設(shè)計藥物，選擇性調(diào)控G蛋白依賴型信號通路或β-arrestin依賴型信號通路?？傊?，雖然偏向性配體藥物走向市場還面臨一些挑戰(zhàn)，但隨著人們對GPCR與配體相互作用以及受體后信號通路的不斷深入了解，偏向性配體在未來會廣泛應(yīng)用于臨床。

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