李 維，程 帆,趙 勝 ,余偉民,饒 婷,阮 遠,袁 潤,姚小兵

(武漢大學人民醫(yī)院：1.麻醉科;2.泌尿外科,湖北武漢 430060)

隨著微創(chuàng)外科理念的迅速發(fā)展，腹腔鏡手術以“創(chuàng)傷小，術后粘連輕，恢復快”等優(yōu)點逐步取代傳統(tǒng)開放手術成為外科手術治療的重要手段，并廣泛應用于各個學科。氣腹的建立是腹腔鏡手術進行的重要一步，在氣體的選擇上，人們進行過不斷的嘗試，包括氮氣，氦氣，二氧化碳等等。其中二氧化碳氣體又以“安全，刺激小，不燃燒，易制取，價格低廉”等優(yōu)點脫穎而出成為目前應用最多的氣體[1]。但是隨著人們對腹腔鏡技術的了解逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)二氧化碳氣腹的建立也存在著種種術后并發(fā)癥[2]。腎臟作為重要的人體器官，其受到二氧化碳氣腹壓的影響尤為重要[3]。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，二氧化碳氣腹壓對人體腎臟的影響主要包括：腎小球濾過率下降，肌酐及尿素氮上升，尿量降低。不少動物實驗研究發(fā)現(xiàn)過高的二氧化碳氣腹壓以及氣腹作用時間的延長會導致組織氧化損傷的加重，最終甚至會導致細胞凋亡[4]。但是氣腹壓引起腎組織細胞凋亡的機制目前并不是很明確，本研究擬通過建立二氧化碳氣腹壓動物實驗模型，評價二氧化碳氣腹壓力對動物腎臟的影響，并探討其可能發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1材料無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級新西蘭大白兔，雌雄不拘，體重2～2.5 kg，購于武漢大學動物研究中心，飼養(yǎng)溫度19～21 ℃，保持通風，正常標準飲食。氣腹機，正置顯微鏡(Nikon 80i)；TUNEL檢測試劑盒(瑞士羅氏公司)；透射電鏡(H-600，日本東京)；電泳儀(武漢谷歌生物)，兔抗Bcl-2多克隆抗體(LSBio)，兔抗Bax多克隆抗體(LSBio)，兔抗Cytc多克隆抗體(Novus)，兔抗caspase3多克隆抗體(abcam)，兔抗β-actin單克隆抗體(abcam)。

1.2實驗分組將18只新西蘭大白兔隨機分為3組：0 mmHg組(對照組)，8 mmHg組(低氣腹壓組)，18 mmHg組(高氣腹壓組)，每組6只，分別給予對應大小的氣腹壓力。

1.3氣腹壓力動物模型建立取10 g/L戊巴比妥鈉(45 mg/kg)沿耳緣靜脈注射麻醉實驗大白兔，仰臥位固定。備皮，于臍旁切一大小約0.5 cm切口，并逐層切開肌肉層至腹腔，從切口處小心插入氣腹針，并連接氣腹機，用縫線縫合密閉腹部傷口，打開氣腹機建立氣腹環(huán)境，各組分別接受對應二氧化碳氣腹壓力(對照組僅連接氣腹針，不行氣體灌注)，氣腹作用時間為2 h。氣腹作用完成后拔出氣腹針，放出腹腔內(nèi)多余二氧化碳氣體，關閉腹腔，并給予80 U/kg青霉素耳緣靜脈注射以預防傷口感染。整個手術操作過程中應盡量避免觸碰腎臟，以免造成人為損傷。

1.4標本留取二氧化碳氣腹作用48 h后沿耳緣靜脈注射過量麻醉劑以處死實驗動物，立即取實驗動物右側腎臟，用冷的生理鹽水充分沖洗干凈，一部分立即行4%多聚甲醛固定，用于石蠟包埋，一部分用2.5%戊二醛固定，用于透射電鏡檢測，另一部分于-80 ℃凍存，用于后期蛋白質(zhì)印跡(Western blot，WB)檢測。

1.5HE染色取小塊兔腎組織，用4%多聚甲醛溶液固定后，脫水透明并行石蠟包埋。包埋后的組織塊經(jīng)切片，脫蠟，染色，透明等步驟行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色。最后于正置顯微鏡下200倍視野觀察腎組織病理學改變，并拍照保存。不同組腎損傷程度采用Paller評分法相互比較，標準為：正常腎小管為0分，腎小管明顯擴張為1分；可見細胞扁平或腫脹為1分；刷狀緣損傷為1分，脫落為2分；管型2分，腎小管管腔內(nèi)有脫落或壞死的細胞為1分。隨機選取5個視野進行評估，評分越高說明腎損傷越嚴重。

1.6TUNEL染色檢測細胞凋亡取上述石蠟包埋組織塊行切片，脫蠟等步驟并按TUNEL試劑盒說明逐步行TUNEL(轉(zhuǎn)移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記，terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay)染色，將染色完成的切片置于正置顯微鏡下，200倍視野對比觀察不同組的腎臟組織染色情況，并拍照保存。TUNEL染色后凋亡的細胞其細胞核呈棕黃色，且形態(tài)不規(guī)則，大小不一致，而正常細胞的細胞核被蘇木素復染成藍色。我們通過計算凋亡指數(shù)來比較不同組腎組織細胞凋亡情況，方法為每張TUNEL切片選取5個陽性細胞數(shù)最多的高倍視野，并計算出陽性細胞所占百分比。

1.7透射電鏡觀察線粒體超微結構取綠豆大小新鮮兔腎臟組織塊，丟入2.5%戊二醛溶液充分固定，再經(jīng)鋨酸固定，梯度乙醇脫水，丙酮包埋，切片及醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色等步驟制作透射電鏡超薄切片。最后在透射電子顯微鏡下8 000倍視野觀察線粒體超微結構改變，并拍照保存。

1.8WB檢測Bcl-2、Bax、Cytc及Caspase-3的含量取適量兔腎組織行液氮研磨，然后加入適量RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)溶液以提取組織總蛋白，然后用聚氯基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)法行蛋白定量。取適量組織總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將分離的蛋白質(zhì)通過電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用脫脂牛奶封閉1 h后，將目的條帶分別與對應的一抗反應(4 ℃，過夜)，PBST(磷酸鹽緩沖液+吐溫)溶液清洗5 min 3次，然后將條帶與羊抗兔熒光二抗反應(常溫，1 h)，PBST溶液清洗5 min，3次最后將條帶放入奧德賽儀器下成像并分析。

2 結 果

2.1HE染色光鏡下可見0 mmHg組和8 mmHg組兔腎臟組織結構正常，而18 mmHg組圖腎臟可見腎小球腎小管細胞輕度水腫，部分腎小管輕度擴張，并有少量炎性細胞浸潤(圖1A)。Paller評分結果示：0 mmHg組(1.1±0.2)分，8 mmHg組(1.5±0.3)分，18 mmHg組(12.2±1.1)分。18 mmHg組與0 mmHg及8 mmHg組相比，Paller評分明顯升高，且差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而0 mmHg與8 mmHg組之間相比差異無顯著性意義(P>0.05)(圖1B)。

圖1不同氣腹壓力作用下的兔腎臟HE染色
A：不同組HE染色圖片；B：不同組Paller評分結果。與0 mmHg組對比，*P<0.05。

2.2TUNEL染色光鏡下觀察不同組TUNEL染色切片，0 mmHg組與8 mmHg組兔腎組織細胞核基本全染成藍色(正常細胞)，極少數(shù)染為棕黃色，而18 mmHg組腎組織中棕黃色細胞核(凋亡細胞)的數(shù)量明顯增多，但比例不高。這些凋亡的細胞不同程度的分布于腎臟組織的各個部分(腎小球，腎小管以及集合管)，其中腎小球血管網(wǎng)和腎小管的凋亡更加明顯(圖2A)。凋亡指數(shù)計算結果示：0 mmHg組(0.04±0.02)，8 mmHg組(0.06±0.01)，18 mmHg組(0.21±0.04)。18 mmHg組與0 mmHg及8 mmHg組相比，凋亡指數(shù)明顯增高，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而0 mmHg組與8 mmHg組相比差異不明顯(P>0.05)(圖2B).

圖2不同氣腹壓力作用下的兔腎臟TUNEL染色
A:不同組腎臟TUNEL染色圖片； B：不同組腎臟凋亡指數(shù)計算結果。與0 mmHg組對比，*P<0.05。

2.3線粒體超微結構透射電子顯微鏡下觀察不同組腎臟細胞線粒體超微結構，0 mmHg組與8 mmHg組兔腎細胞內(nèi)的線粒體形態(tài)結構完整，可見正常的線粒體內(nèi)膜外膜以及線粒體嵴。而18 mmHg組兔腎細胞內(nèi)部分線粒體發(fā)生腫脹，有空泡形成，并發(fā)生線粒體嵴的斷裂，有的線粒體甚至發(fā)生膜的破裂導致基質(zhì)外漏(圖3A)。異常線粒體比例結果顯示：0 mmHg組(3.1±0.4)%，8 mmHg組(4.5±0.5)%，18 mmHg組(24.2±3.6)%。18 mmHg組與0 mmHg及8 mmHg組相比，腫脹的線粒體比例明顯增高，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而0 mmHg與8 mmHg組的線粒體均正常，無顯著差異(P>0.05)(圖3B)。

圖3不同氣腹壓力作用下的兔腎臟線粒體結構變化

A:不同組腎臟電鏡下線粒體超微結構圖片，圖中*標記的為腫脹的異常線粒體； B：不同組異常線粒體所占比例。與0 mmHg組對比，*P<0.05。

2.4Bcl-2、Bax、Cytc及Caspase-3表達量WB檢測結果顯示：18 mmHg組與0 mmHg組及8 mmHg組相比，Bax的表達量明顯升高(P<0.05);Bcl-2表達量明顯降低(P<0.05)(圖4A、B)；Cytc表達量明顯升高(P<0.05)；Cleaved-caspase-3表達量明顯升高(P<0.05)(圖4A、B)；而Pro-caspase-3表達量3組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，同時0 mmHg組與8 mmHg組相比，上述各項蛋白表達量差異均不明顯(P>0.05)。

圖4不同氣腹壓力作用下兔腎組織Bcl-2、Bax、Cytc及caspase-3表達量

A:不同組兔腎組織各個指標western blot結果圖，條帶灰度值的深淺代表該蛋白表達量的高低； B：不同組兔腎臟Bcl-2.Bax相對表達量； C：不同組兔腎臟Cytc及caspase3相對表達量。與0 mmHg組對比，*P<0.05。

3 討 論

許多國內(nèi)外的臨床及動物研究發(fā)現(xiàn)，過高及持續(xù)時間過久的二氧化碳氣腹壓會對機體腎臟產(chǎn)生不良影響，其原因主要包括以下3個方面：①氣腹壓會直接壓迫腎臟引起腎皮質(zhì)血流減少，從而導致組織缺血缺氧，當氣腹壓撤除之后腎臟血流灌注恢復，缺血再灌注損傷繼而發(fā)生；②氣腹壓可以直接壓迫靜脈血流如中心靜脈，導致靜脈回流障礙，有效循環(huán)血容量降低，從而腎總的血流量也隨之下降；③機體對二氧化碳氣體的吸收會通過一系列復雜的變化引起心臟輸出量的改變[5-6]。這3個方面最終會導致腎臟缺血缺氧并發(fā)生缺血再灌注損傷。為了對手術中氣腹壓力的掌控以及腎臟氣腹壓損傷的功能保護提供科學的理論依據(jù)，我們的研究著重探討了二氧化碳氣腹壓力對兔腎臟損傷作用以及這種損傷可能發(fā)生的具體機制。

在缺血缺氧引起的細胞損傷以及凋亡的分子機制中，線粒體介導的細胞凋亡途徑是最為常見的細胞凋亡機制之一[7]。在這種凋亡機制中，缺血缺氧及缺血再灌注導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生，鈣離子超載等，這些上游的凋亡信號通過Bcl家族蛋白調(diào)節(jié)細胞內(nèi)線粒體膜電位以及線粒體膜的通透性，從而控制線粒體內(nèi)細胞色素C(cytochrome C,Cytc)的釋放。其中Bcl-2蛋白能夠保存膜電位，從而阻止Cytc的釋放，而Bax蛋白可以消除線粒體膜電位，從而促進Cytc的釋放[8]。從線粒體內(nèi)釋放的Cytc首先與胞質(zhì)中的Apaf-1結合，然后與caspase-9反應，激活Pro-caspase-9生成Cleaved-caspase-9，然后繼續(xù)活化下游的caspase蛋白，如caspase-3。被活化的caspase-3最終裂解成小片段Cleaved-caspase-3，并特異性的切割某些與細胞活性相關的蛋白質(zhì)，最終導致細胞凋亡的發(fā)生[9-10]。

在本研究中，當二氧化碳氣腹壓升高到18 mmHg時，HE染色以及Paller評分的結果說明腎組織損傷明顯加重了，這可能與該氣腹壓力下活性氧的大量產(chǎn)生有關。WB結果顯示促凋亡蛋白Bax的表達量升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達量降低，同時電鏡下也觀察到異常腫脹的線粒體比例明顯增加，這些變化均提示在該氣腹壓力作用下線粒體膜電位發(fā)生丟失，而且線粒體膜的通透性增加。另外，WB結果還顯示Cytc以及Cleaved-caspase-3表達量明顯升高，說明Cytc從組織線粒體內(nèi)大量釋放到胞漿并激活Pro-caspase-3生成了Cleaved-caspase-3片段，最終導致腎組織細胞凋亡的發(fā)生。另一方面，TUNEL染色結果顯示18 mmHg組兔腎臟凋亡指數(shù)明顯增加也支持了這一點。綜上所述，過高的二氧化碳氣腹壓會通過多個方面導致腎實質(zhì)的缺血缺氧并發(fā)生缺血再灌注損傷，此時大量產(chǎn)生的ROS會改變線粒體膜電位及線粒體膜的通透性，并引起凋亡相關蛋白Bcl-2、Cytc、caspase等的表達量的改變，最終引起腎組織細胞的凋亡。因而我們得出結論：過高的二氧化碳氣腹壓會導致兔腎臟細胞發(fā)生凋亡，而且這種凋亡的機制可能與線粒體介導的細胞凋亡途徑相關。

[1] ISHIZAKI Y，BANDAI Y，SHIMOMURA K,et al. Changes in splanchnic blood flow and cardiovascular effects following peritoneal insufflation of carbon dioxide[J]. Surg Endosc，1993，7(5): 420-423.

[2] PAPPARELLA A，NINO F，COPPOLA S，et al. Peritoneal morphological changes due to pneumoperitoneum: the effect of intra-abdominal pressure[J]. Eur J Pediatr Surg,2014，24(4): 322-327.

[3] DE BARROS R F，MIRANDA M L，DE MATTOS A C，et al. Kidney safety during surgical pneumoperitoneum: an experimental study in rats[J]. Surg Endosc，2012，26(11): 3195-3200.

[4] SOUZA D B，COSTA W S，CARDOSO L E，et al. Does prolonged pneumoperitoneum affect the kidney? Oxidative stress，stereological and electron microscopy study in a rat model[J]. Int Braz J Urol，2013，39(1):30-36.

[5] BISHARA B，RAMADAN R，KARRAM T，et al. Nitric oxide synthase inhibition aggravates the adverse renal effects of high but not low intraabdominal pressure[J]. Surg Endosc，2010，24(4): 826-833.

[6] BEN-HAIM M，ROSENTHAL RJ. Causes of arterial hypertension and splachnic ischemia during acute elevations in intra-abdominal pressure with CO2pneumoperitoneum: a complex central nervous system mediated response[J]. Int J Colorectal Dis,1999,14(4-5):227-236.

[7] KWAK GH，KIM TH，KIM HY. Down-regulation of MsrB3 induces cancer cell apoptosis through reactive oxygen species production and intrinsic mitochondrial pathway activation[J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，483(1): 468-474.

[8] KROEMER G，GALLUZZI L，BRENNER C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death[J]. Physiol Rev,2007，87(1): 99-163.

[9] ZHANG J，YU Q，HAN L，et al. Study on the apoptosis mediated by cytochrome c and factors that affect the activation of bovine longissimus muscle during postmortem aging[J]. Apoptosis，2017，22(6): 777-785.

[10] HASSOUN HT，LIE ML，GRIGORYEV DN，et al. Kidney ischemia-reperfusion injury induces caspase-dependent pulmonary apoptosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(1): F125-F137.

(編輯 何宏靈)