楊 煜, 呂文偉, 呂若谷, 安 鋼

(1. 吉林大學 基礎醫(yī)學院, 吉林 長春 130021；2. 吉林大學 公共衛(wèi)生學院, 吉林 長春 130021)

離子通道是細胞膜上的一類特殊跨膜蛋白質構成的門樣通道。這些蛋白質的中央形成的孔道有利于離子穿過,是無機離子進出細胞的重要物質載體,對維持細胞內離子濃度和配比平衡及機體代謝穩(wěn)定起重要作用。離子運輸具有選擇性和開關性(可控制性)[1]。離子通道電流測量通常依靠昂貴的膜片鉗-離子通道測量平臺才能實現,而我校教學實驗室不具備進行該實驗的設備條件。為此,采用計算機仿真技術模擬實驗操作環(huán)境,研制了離子通道電流虛擬仿真實驗教學設備,在無膜片鉗-離子通道測量平臺設備的情況下開設了生理學測量離子單通道電流的教學實驗,建立新型實驗教學模式[2]。

1 離子通道電流虛擬仿真儀器特點

離子通道電流虛擬仿真實驗儀器主要應用于生物電生理實驗教學,可用于心臟、肝臟、神經、肌肉等多臟器的實驗項目[3-9],對學生掌握抽象的離子通道蛋白的電生理特性及理解電生理理論起到促進作用。通過該實驗,可以拓展對離子通道電流儀實驗結果的分析和應用[10-12],培養(yǎng)學生在離子通道蛋白的電生理特性方面的科研能力。

生理教學的靜息電位和動作電位以及神經調節(jié)等生理過程都是以離子通道蛋白分子的電生理特性為基礎的。離子通道電流虛擬仿真實驗儀器能夠模擬膜片鉗位實驗操作環(huán)境,以較低的成本為本科生開設離子單通道電流仿真實驗[13]。該儀器已申報國家專利(專利號:ZL 201420248873x)。

2 離子通道電流虛擬仿真儀器功能

離子通道電流仿真實驗教學儀器的功能可分為封接實驗、全細胞鉗實驗、膜片鉗實驗、全細胞鉗實驗數據分析和膜片鉗實驗數據分析等5部分。

(1) 封接實驗。所謂封接就是使細胞與測量電極緊密接觸。調節(jié)測量電極，使通過細胞孵育液的電流接近0,當測量電極通過細胞時檢測的電流就是離子通道蛋白的電流。由于細胞的測量電極很小,很難通過感官判斷封接的接觸緊密程度；而通過儀器產生電壓和電流,測量電極接收回路電流,就可測量封接電阻，從而監(jiān)視接觸緊密程度。封接電阻越大,則緊密接觸程度則越高。當封接電阻值達到1 GΩ時便可進行實驗。在實驗過程中,封接操作是實驗的難點。通過使用離子通道電流仿真實驗教學設備的負壓注射器,可以觀察模擬封接過程的電阻變化。學生親自動手進行封接實驗,從而掌握電壓鉗技術、膜片鉗技術和實驗操作技能[14]。

(2) 全細胞鉗實驗。通過軟件選單選擇全細胞鉗實驗界面,輸入最小鉗制電壓、最大鉗制電壓、鉗制電壓變化的間隔等實驗操作的參數,然后用鼠標單擊“開始實驗”按鈕,記錄實驗結果。學生直接觀察到逼真的離子通道蛋白在不同的鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線(見圖1)。

圖1 全細胞離子通道電流測試曲線

(3) 全細胞鉗實驗數據分析。在全細胞鉗實驗結束后,通過軟件選單選項進入全細胞鉗實驗分析界面(見圖2)。首先選擇實驗分析的時間段,然后用鼠標單擊“電流電壓曲線”按鈕。針對不同鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線進行分析和處理,從而可以得到電壓-電流分析曲線,在電壓-電流分析曲線上能直接看到細胞的某種離子通道蛋白的電壓依賴特性。

圖2 全細胞離子通道電流電壓分析曲線

(4) 膜片鉗實驗。選擇全細胞鉗實驗界面，輸入采樣頻率、采樣保持電壓、采樣屏數等實驗操作參數,然后用鼠標單擊“開始”按鈕,記錄和直接觀察到單個離子通道在特定鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線(見圖3)。

圖3 單離子通道電流開放和關閉測試曲線

(5) 膜片鉗實驗數據分析。在膜片鉗實驗結束后,選擇膜片鉗實驗分析界面。輸入實驗分析相應的閾值參數,以便計算機自動識別通道的開放和關閉。單擊開放時間統(tǒng)計按鈕,將產生通道開放時間統(tǒng)計曲線；單擊關閉時間統(tǒng)計按鈕,將產生通道關閉時間統(tǒng)計曲線。對特定鉗位電壓下的電流隨時間的變化曲線進行分析和處理,可以得到單離子通道蛋白開放和關閉特性的統(tǒng)計分析曲線,從而直觀地看到細胞的某種離子通道蛋白的開關特性(見圖4)。

圖4 單離子通道電流開放時間統(tǒng)計曲線

3 實驗操作

(1) 進行電極制備,用電極拉制器拉制幾兆歐的電極,沖灌電極液。取蛙卵細胞并放入帶有孵育液的平皿中待用。

(2) 將準備好的電極小心裝入電極支架固定。在顯微鏡下找到平皿中的細胞,將電極對準細胞,在顯微鏡下繼續(xù)小心放下電極,使電極與細胞接觸。

(3) 小心、緩慢地抽吸連有電極的注射器,給細胞加負壓,實現封接過程。

(4) 在封接過程中,由于注射器帶動封接電位器滑動引起電阻的變化,通過封接電阻檢測電路檢測電阻的變化。

(5) 將檢測電阻的變化通過A/D轉換電路經過數字轉化后輸入中央控制器。

(6) 中央控制器通過微機通信接口電路將檢測電阻的值輸入微機,然后在軟件系統(tǒng)控制下在微機屏幕上顯示。一邊加負壓,一邊觀察,在微機的軟件界面監(jiān)控封接過程。如果封接電阻值達到1 GΩ,則表示封接成功。

(7) 封接成功后,進入實驗記錄過程。微機顯示仿真實驗的數據并且通過分析軟件來完成仿真實驗數據的分析。

4 結語

通過對離子通道電流虛擬仿真實驗儀器的實驗操作過程,學生能夠觀察到離子通道蛋白分子的電流記錄曲線,較容易掌握離子通道的選擇性。通過分析處理得到電壓-電流分析曲線和通道關閉時間的統(tǒng)計曲線,較易理解離子通道的開放性,從而啟發(fā)學生對離子通道蛋白的開-關特性和電壓依賴特性的理解。結合仿真實驗曲線分析腦部缺血、缺氧和再灌注損傷情況下的生理改變,能夠更好地理解鈉通道、鈣通道細胞內外的跨膜離子濃度變化導致神經細胞急性滲透性腫脹的原因,為臨床治療急性缺血性腦卒中的藥物選擇提供理論依據。結合介紹有關離子通道的最前沿科研論文并組織課堂討論[14-16],可以促進學生對生理學理論知識的應用,極大地提升了實驗課的教學效果。

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