魏國(guó)美

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002；2.國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 福州 350002）

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，是現(xiàn)有抗生素中使用最廣泛的一類，其中包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑等，由于其廣譜、高效、低毒而在畜牧業(yè)中廣泛使用。雖然?-內(nèi)酰胺類藥物本身沒(méi)有很強(qiáng)的毒性，但會(huì)引起一些個(gè)體產(chǎn)生劇烈致命的過(guò)敏反應(yīng)，以及破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性等[1]，因此許多國(guó)家包括我國(guó)對(duì)動(dòng)物使用這類藥物和殘留實(shí)行嚴(yán)格地監(jiān)控管理，并提出殘留的限量要求。

目前，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析、檢測(cè)的方法主要有儀器分析法、免疫分析法和微生物測(cè)定法[1]，其中微生物法具有樣品前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、不需要昂貴的儀器、可對(duì)大批量樣品進(jìn)行初篩等優(yōu)點(diǎn)[2]。本研究對(duì)SN/T 2127-2008標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了部分優(yōu)化和修改，現(xiàn)介紹如下：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

恒溫箱、離心機(jī)、高速組織搗碎機(jī)、恒溫水浴鍋、渦旋振蕩器和顯微鏡、游標(biāo)卡尺。

1.2 材料及器皿

滅菌平皿（直徑90 mm）、圓形濾紙片（直徑10 mm，厚1.1 mm）、克氏瓶和可調(diào)移液器。

1.3 菌種

嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus ATCC10149。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基

胰蛋白胨17.0 g，植物蛋白胨3.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g，pH（7.3±0.2）。

1.4.1 細(xì)菌保存培養(yǎng)基

胰蛋白胨15.0 g，植物蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH（7.3±0.2）。

1.4.2 菌種芽孢培養(yǎng)基

胰蛋白胨17.0 g，植物蛋白胨3.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，pH（7.3±0.2）。

1.4.3 測(cè)定用培養(yǎng)基

牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，大豆蛋白胨0.3 g，葡萄糖5.25 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.25 g，吐溫-80 1.0 g，溴甲酚紫0.06 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH（7.8±0.2）。

1.5 試劑

1.5.1 pH6.0磷酸鹽緩沖液

8.0 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）及2.0 g磷酸氫二鉀（KH2PO4），用蒸餾水溶解并定容至1000 mL，121℃高壓滅菌15 min。

1.5.2 磷酸鹽—丙酮緩沖液

按體積比，pH6.0磷酸鹽緩沖液∶丙酮=1∶1比例制備。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取一定量的青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品，用少量甲醇溶解后，再用滅菌pH6.0磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000μg/mL，置2～8℃冰箱保存，貯存保質(zhì)期7 d（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，有效期內(nèi)使用）。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液

吸取一定量的各種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，應(yīng)當(dāng)日配制使用。

1.6 測(cè)定步驟

1.6.1 樣液提取

1.6.1.1 牛乳

取20 mL牛乳于50 mL離心管，3000 r/min離心5min，除去脂肪層，以1.0 mol/L鹽酸液或1.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5～7.0。脫脂奶可直接用于檢測(cè)。

1.6.1.2 肉類、魚(yú)和蝦

稱取10 g均質(zhì)好的試樣于50 mL離心管中，加入磷酸鹽—丙酮緩沖液10 mL，30 min后，3000 r/min離心15 min，取上清液作為樣液。

1.6.2 菌懸液的制備

嗜熱脂肪芽孢桿菌菌懸液：一般情況下，菌種的傳代次數(shù)不應(yīng)超過(guò)5代，否則在每次使用前確證其生化特性沒(méi)有發(fā)生變異，或另需購(gòu)置新的標(biāo)準(zhǔn)菌株。在確定保存的菌種生化特性沒(méi)有改變后，將菌種接在胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基中55 ℃培養(yǎng)1~2 d后，取此菌液接種于裝有芽孢培養(yǎng)基的克氏瓶中，（55±1）℃培養(yǎng)72 h，鏡檢芽孢數(shù)達(dá)80%以上（如果達(dá)不到，可再培養(yǎng)，芽孢數(shù)仍達(dá)不到要求，菌種可能變異，不可使用），用滅菌生理鹽水洗下菌苔，混勻3000 r/min離心20 min棄去上清，加滅菌生理鹽水洗滌，再離心，棄去上清后加滅菌生理鹽水制成菌懸液，先用麥?zhǔn)蠞岫扔?jì)計(jì)數(shù)后用平板法計(jì)數(shù)以確定菌種的濃度。于2～8 ℃冰箱保存，貯存期30 d。

1.6.3 測(cè)定用平板的制備

將菌懸液按一定的比例加入到融化后冷卻至60 ℃左右的滅菌檢測(cè)用培養(yǎng)基中充分混勻后，使平板中的嗜熱脂肪芽孢桿菌的濃度達(dá)到約2.0×106cfu/mL。先在滅菌平皿中入加檢定培養(yǎng)基鋪底層，待凝固后（約30 min）再加入6 mL混合液，保持水平待其凝固。取制備好的檢定用平板2個(gè)，分別放置2個(gè)濾紙片，加入約80 μL（以紙片吸滿為準(zhǔn)）0.005 μg/mL，青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液，冷藏放置30 min后，（63±1）℃培養(yǎng)4.5 h能產(chǎn)生直徑為14 mm以上清晰、完整抑菌圈的平板為合格，達(dá)不到要求的平板應(yīng)棄去。制備好的平板于2～8 ℃冰箱可保存2～3 d。

1.6.4 測(cè)定

取制備好的檢定用平板2個(gè)，在平板底部作好標(biāo)記，將濾紙片適當(dāng)間隔置于平板上，每個(gè)平板最多不超過(guò)6個(gè)，在其中一個(gè)濾紙片加入約90μL（以紙片吸滿為準(zhǔn)）0.005 μg/mL，青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液作為陽(yáng)性對(duì)照，其余的濾紙片中加入約80 μL樣液，冷藏放置30 min后，（63±1）℃培養(yǎng)4.5 h后開(kāi)始觀察，如果0.005 μg/mL青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生清晰、完整的抑菌圈且直徑大于14 mm時(shí)終止培養(yǎng)，記錄標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液的抑菌圈結(jié)果。每份樣品做2個(gè)平板上的平行試驗(yàn)。

1.6.5 檢測(cè)結(jié)果的判定

如果樣液在平板上無(wú)抑菌圈，0.005 μg/mL青霉素G標(biāo)準(zhǔn)工作液的抑菌圈直徑大于14 mm，即判定“陰性”。如果樣液在平板上呈現(xiàn)抑菌圈，抑菌圈直徑在13 mm以上，即判定為“初篩陽(yáng)性”[3]。

2 討論

上述方法在以下幾點(diǎn)是對(duì)SN/T 2127-2008標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化和補(bǔ)充

⑴ 在菌種的制備上明確先用胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基復(fù)活增菌24~48 h后，取此菌液接種菌種芽孢培養(yǎng)基55 ℃培養(yǎng)2 d后37 ℃培養(yǎng)7 d，這樣能增加產(chǎn)芽孢數(shù)。

⑵ 芽孢懸液制備時(shí)，洗下菌苔，制成懸液，先離心并洗滌2次，以去除培養(yǎng)基成份。

⑶ 確定芽孢懸液濃度時(shí)，先用麥?zhǔn)蠞岫葍x粗粗略測(cè)定懸液濃度，再平板精確計(jì)數(shù)這樣就減少工作量并能準(zhǔn)確獲知懸液的菌濃度，也可用麥?zhǔn)蠞岫葍x測(cè)定后，在制測(cè)定平板前先試圈，方法為：取此菌懸液若干加入測(cè)定培養(yǎng)基中，制成幾種含不同菌濃度的檢定平板，后加0.005 ug/mL青霉素G，選擇其抑菌圈直徑大于14 mm且清晰的平板，該平板的菌濃度為正式試驗(yàn)的菌液添加量。

⑷ 檢定平板中的嗜熱脂肪芽孢桿菌的濃度達(dá)到2.0×106cfu/mL時(shí)比濃度為1.0×106cfu/mL更優(yōu)，前者抑菌圈界線清晰，而后者界線模糊，不好觀察測(cè)量。

⑸ 制檢定平板時(shí)，先在皿底部鋪一層檢定培養(yǎng)基（約10 mL），后再在其上加含有菌液的檢定培養(yǎng)基，否則會(huì)造成抑菌圈不規(guī)則難以測(cè)量，而且容易干裂，造成實(shí)驗(yàn)失敗。

3 小結(jié)

β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測(cè)方法目前主要有微生物法、儀器分析法和免疫分析法等。液相色譜和氣相色譜等方法比微生物法有更高的靈敏度和特異性，但是存在前處理繁瑣、樣品回收率不高，而且設(shè)備昂貴、操作要求高、分析費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。微生物法不需昂貴的儀器，易操作，適合于大量樣品的篩選，是儀器分析、免疫分析等其它方法的有益補(bǔ)充，但它只能測(cè)定總量，不能進(jìn)行定性，陽(yáng)性樣品須用其它方法進(jìn)行確證。本研究通過(guò)對(duì)SN/T 2127-2008標(biāo)準(zhǔn)部分細(xì)節(jié)的修改和補(bǔ)充，使得該方法更具可操作性，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將更加理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳號(hào),彭開(kāi)松,朱良強(qiáng),等.動(dòng)物源食品中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志,2008,42(5)：42-45.

[2]吳謙,鄭晶,黃曉蓉,等.動(dòng)物源性食品中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測(cè)微生物抑制法的建立[J].福建畜牧獸醫(yī),2009,31(2)：19-22.

[3]國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì).進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測(cè) 微生物抑制法：SN/T 2127-2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.