曾偉， 江艾西， 涂金華， 湯行春

(湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 430062)

阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)為一類(lèi)分布于植物細(xì)胞中富含羥脯氨酸且高度糖基化的糖蛋白家族[1-2]。人們采用生理生化、免疫組化以及分子生物學(xué)等技術(shù)對(duì)AGPs的生物學(xué)功能進(jìn)行了較為深入的研究，結(jié)果表明，AGPs參與了植物細(xì)胞增殖與膨脹、細(xì)胞分化、有性生殖中配子發(fā)育、胚胎模式建成等[2-5]。高等植物的有性生殖涉及雌雄配子體發(fā)育、雌雄配子的識(shí)別以及胚胎發(fā)生等過(guò)程，它在植物生活史占有重要地位，已有研究和綜述對(duì)這方面的工作進(jìn)行了闡述[ 6-8]。因此，本文僅就AGPs在植物根發(fā)育過(guò)程中的作用以及根與微生物相互作用進(jìn)行評(píng)述。

1 AGPs的分子結(jié)構(gòu)與作用模式

1.1 AGPs的分子結(jié)構(gòu)與類(lèi)型

AGPs由核心蛋白骨架及糖基側(cè)鏈組成，核心蛋白骨架富含羥脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，而糖基側(cè)鏈主要包括半乳糖和阿拉伯糖。由于不同AGPs的核心蛋白骨架、糖基側(cè)鏈組成成分以及糖基化修飾位點(diǎn)均具有較大差異，因此, AGPs是高度異質(zhì)性的糖蛋白[9]。目前，AGPs可分為經(jīng)典AGPs(classical AGPs)、非經(jīng)典AGPs(non-classical AGPs)、AG(acid glycoprotein)肽和類(lèi)成束蛋白AGPs(fasciclin-like AGPs，F(xiàn)LAs)[1]。

經(jīng)典 AGPs由N-端信號(hào)序列、富含 Hyp/Pro、Ala、Ser/Thr 的中間可變區(qū)以及C-端疏水區(qū)3個(gè)部分組成。C-端疏水區(qū)被認(rèn)為是GPI錨(glycosylphosphatidylinositol，GPI-anchor),40%的GPI 錨含有 AG 糖基元件[11-12]。GPI錨的合成比較復(fù)雜，是經(jīng)典AGPs與非經(jīng)典AGPs最重要的區(qū)別，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的外側(cè)，由不同PIG(phosphatidylinositol glycan)與GPI1組成的復(fù)合酶將N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移到磷脂酰肌醇上，經(jīng)PIG-L酶處理后成為Gn-PI，再經(jīng)構(gòu)象變化并由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的外側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi)側(cè)，隨后在酶的作用下將3個(gè)甘露醇連接到PIG上，并通過(guò)GPI8，GAA1將合成的蛋白骨架在C-末端的相應(yīng)位點(diǎn)切割下來(lái)，GPI錨通過(guò)轉(zhuǎn)酰胺基作用加到此處，而后將未成熟的AGPs轉(zhuǎn)移到高爾基體上并添加糖基側(cè)鏈，通過(guò)小泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上[13]。

非經(jīng)典AGPs不僅具有Hyp/Pro富集區(qū)域，而且富含天冬酰胺(Asn)或半胱氨酸(Cys) 區(qū)域[9,13]。與經(jīng)典AGPs不同的是，非經(jīng)典的 AGPs 不具有 GPI 錨，其核心蛋白骨架比經(jīng)典AGPs的異質(zhì)性更高[12-13]。AG肽為僅具有10～15氨基酸的成熟蛋白骨架。類(lèi)成束蛋白AGPs常被稱(chēng)為嵌合的AGPs，不僅包含一個(gè)AGP的基本框架，還含有1～2個(gè)具有黏附作用的成束蛋白結(jié)構(gòu)域[13-14]。

1.2 AGPs的作用模式

AGPs的結(jié)構(gòu)中包含有不同類(lèi)型的糖鏈，有些AGPs還具有GPI錨的特征。根據(jù)不同類(lèi)型的AGPs結(jié)構(gòu)特征，人們推測(cè)AGPs的作用模式，一種作用模式認(rèn)為，AGPs側(cè)鏈的糖基可以被專(zhuān)一酶類(lèi)水解后釋放到胞外基質(zhì)中，這些糖基分子可以充當(dāng)信號(hào)分子或營(yíng)養(yǎng)[2,9]；另一種作用模式認(rèn)為，經(jīng)典AGPs的GPI錨被切割后，整個(gè)AGP蛋白釋放，其本身就可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。最近，有研究表明，AGPs可以作為Ca2+的螯合劑，在一些特殊條件下，AGPs可以使細(xì)胞控制Ca2+的釋放[15]。另外，Olmos等[16]提出一種新的作用模式，他們認(rèn)為，在鹽脅迫下，AGPs可能作為鈉離子載體經(jīng)膜泡運(yùn)輸，將鈉離子從質(zhì)外體轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡，使細(xì)胞適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。盡管如此，人們所提出的這些作用并不互相排斥，相反，這些大分子的復(fù)雜特點(diǎn)可能導(dǎo)致它們采取不同的方式調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。隨著分子生物學(xué)的興起，人們對(duì)一些AGPs的基因序列和表達(dá)模式有了一定了解，結(jié)合免疫組化技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)和手段為AGPs的功能研究提供了新的方法。

2 AGPs與根的發(fā)育

最初，人們利用AGPs的特異性抗體來(lái)揭示其在植物組織中的定位，單克隆抗體大多數(shù)是針對(duì)AGPs的側(cè)鏈糖基，比較常用的AGPs抗體有JIM系、MAC系以及LM系[9]。不同單克隆抗體識(shí)別的AGPs在植物根組織發(fā)育中有其特定的分布，JIM4識(shí)別的AGPs與胡蘿卜根早期維管組織的發(fā)育相關(guān)，可以作為中柱鞘細(xì)胞發(fā)育的分子標(biāo)記，JIM14識(shí)別AGPs與根細(xì)胞中次生加厚的篩管有關(guān)[17]，而JIM13識(shí)別的AGPs定位在幼嫩的木質(zhì)部以及根冠和邊緣細(xì)胞中[18]；在單子葉禾本科植物大麥的根毛發(fā)育中，LM2、LM14識(shí)別的AGPs定位于野生型的根毛生發(fā)細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中，而無(wú)根毛的突變體僅出現(xiàn)在所有表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[19]，這些結(jié)果暗示不同抗體識(shí)別的AGPs參與根的次生組織細(xì)胞壁加厚以及形成層細(xì)胞分化的調(diào)控。結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，基于AGPs相關(guān)基因的表達(dá)模式也進(jìn)一步證實(shí)了多種類(lèi)型的AGPs基因在根的不同組織部位特異性表達(dá)，其中包括一些非典型AGPs，如AtAGP30定位在根的伸長(zhǎng)區(qū)，AtAGP31、AtFLA1定位在根的韌皮部和初生木質(zhì)部[20-23]，且這些AGPs在根中的分布隨發(fā)育進(jìn)程而改變，推測(cè)AGPs在根的形態(tài)建成中起非常重要的作用。

AtAGP30為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)在擬南芥根中特異表達(dá)且富含組氨酸的AGPs基因，在根分生組織和伸長(zhǎng)區(qū)的非根毛表皮細(xì)胞中表達(dá)，參與了這些細(xì)胞的形態(tài)維持、根的再生[20]。用AGPs專(zhuān)一結(jié)合的β-GlcY試劑[(β-glucosyl)3]Yariv等[3]處理agp30突變體，由于突變體中缺少某種AGPs，其根的表面不像用β-GlcY試劑處理野生型那樣出現(xiàn)更嚴(yán)厲的表型。該突變體還表現(xiàn)出對(duì)激素ABA和乙烯的敏感性降低，推測(cè)AtAGP30 基因可能參與了ABA應(yīng)答，也有可能作為細(xì)胞壁相關(guān)激酶信號(hào)途徑的成員之一參與根表皮細(xì)胞早期發(fā)育的調(diào)控[20,22]。AtAGP31是與AtAGP30同源的非典型AGPs，其在維管組織的韌皮部和初生木質(zhì)部?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)[21]，且受脅迫響應(yīng)因子如茉莉酸甲酯負(fù)調(diào)控,推測(cè)該基因可能參與根的維管組織發(fā)育以及非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。然而，這些AGPs在此生理過(guò)程中如何發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。AtFLA1 基因在側(cè)根的成熟維管組織以及主根的伸長(zhǎng)區(qū)中表達(dá),該基因突變導(dǎo)致植株側(cè)根數(shù)目增加,根的再生能力減弱，雖然AtFLA1基因功能尚不明確，但有研究證實(shí)，該基因家族的其他成員AtFLA11和AtFLA12通過(guò)調(diào)控根細(xì)胞的次生壁結(jié)構(gòu)和成分發(fā)揮功能[23]，此外，擬南芥SOS5/FLA4基因編碼與細(xì)胞黏附相關(guān)的FLA蛋白,在鹽脅迫下,sos5/fla4突變體的根生長(zhǎng)減少，表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞和內(nèi)皮層細(xì)胞出現(xiàn)異常膨脹，實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示SOS5蛋白可能通過(guò)fasciclin結(jié)構(gòu)與細(xì)胞壁的其他成分相互作用構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，來(lái)維持細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和適度的細(xì)胞膨脹[22-23]。最近，有研究表明，AtFLA4在擬南芥根組織中表達(dá)，并參與了多種遺傳功能與信號(hào)途徑，F(xiàn)LA4包含有GPI錨，其GPI錨可以錨定特定蛋白，GPI錨定的蛋白在GPI專(zhuān)一的磷脂酶或其他酶的作用下，將錨定的蛋白釋放于胞外空間從而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育[24-25]。

擬南芥reb1-1(rootepidermalbulger)突變體的根生長(zhǎng)受到明顯抑制，主要表現(xiàn)在伸長(zhǎng)區(qū)的表皮細(xì)胞異常膨脹，而根冠和分生組織細(xì)胞發(fā)育正常。生理生化研究證實(shí)，突變體根組織細(xì)胞的細(xì)胞壁成分缺少LM2和JIM14識(shí)別的AGPs[26]，用β-GlcY處理野生型幼苗導(dǎo)致類(lèi)似于突變體的表型[27]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，β-GlcY可以引起生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體蛋白PIN2的表達(dá)模式改變，且胞質(zhì)中的囊泡運(yùn)輸不能準(zhǔn)確定位(未發(fā)表資料)。reb1-1編碼UDP-D-葡萄糖差向異構(gòu)酶，該酶具有將D-葡萄糖轉(zhuǎn)換成D-半乳糖的能力，為AGPs蛋白骨架提供半乳聚糖[26]，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充10 mmol/L的半乳糖可以恢復(fù)突變體的表型和根中AGPs的含量，因此，AGPs在伸長(zhǎng)區(qū)控制細(xì)胞的膨脹是必需的。擬南芥的另一個(gè)突變體mur1(murus1)中AGP糖蛋白包含較少的末端巖藻糖殘基，導(dǎo)致根的形態(tài)和伸長(zhǎng)發(fā)生改變，從鰻魚(yú)中提取的凝集素能專(zhuān)一結(jié)合到AGPs末端巖藻糖殘基上，添加該物質(zhì)可以導(dǎo)致野生型幼苗的根的表型與突變體mur1相似。這進(jìn)一步說(shuō)明巖藻糖基化的AGPs在控制根的生長(zhǎng)和發(fā)育有非常重要的作用[28]。

AGPs作為植物細(xì)胞質(zhì)外體的成分之一，reb1-1突變體根的表皮細(xì)胞膨脹表現(xiàn)出異常的微管分布[27]，暗示質(zhì)膜/細(xì)胞壁與細(xì)胞骨架之間可能存在某種聯(lián)系。AGPs插入質(zhì)膜外部是通過(guò)接近微管的GPI錨定部位完成的，從番茄克隆到的一個(gè)經(jīng)典AGPs基因LeAGP-1，該基因GPI錨的缺失表達(dá)導(dǎo)致植株矮小,表明GPI錨對(duì)于細(xì)胞壁與質(zhì)膜之間連接的重要性[29]。進(jìn)一步用單克隆抗體和β-GlcY試劑處理擬南芥野生型幼苗，根表皮細(xì)胞微管引起快速反應(yīng)失去正常分布，且伴隨著質(zhì)膜外側(cè)AGPs定位發(fā)生改變[27]，同樣的方式處理煙草BY-2細(xì)胞也表現(xiàn)出類(lèi)似的結(jié)果，反過(guò)來(lái)，細(xì)胞骨架相關(guān)藥物也影響AGPs的定位[30]，說(shuō)明了AGPs與細(xì)胞骨架元件存在著緊密性連接。最近，有人認(rèn)為磷脂酶D、細(xì)胞壁相關(guān)激酶和凝集素受體激酶可能作為潛在因子在質(zhì)膜某些專(zhuān)一區(qū)域如脂筏，充當(dāng)連接子連接AGPs與細(xì)胞骨架來(lái)介導(dǎo)信息交流[16,31]。

3 AGPs參與植物-環(huán)境微生物互作體系

AGPs除了參與根的形態(tài)建成外，還參與了根與環(huán)境微生物間的相互作用。這種相互作用多方面的，既可通過(guò)與微生物共生有利于植物生長(zhǎng)發(fā)育，也可以以拮抗的方式導(dǎo)致植物發(fā)病[32-33]。

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，根系能分泌有些特定物質(zhì)，這些特定物質(zhì)通過(guò)改變其土壤微生態(tài)環(huán)境從而保持特定微生物種群。豌豆根的分泌物中含能被LM2和JIM13識(shí)別，卻不能被MAC265識(shí)別的AGPs，用蛋白酶和糖苷酶處理后可以抑制根瘤菌的極性黏附[34]，表明根際分泌物的碳水化合物基元和蛋白骨架對(duì)根瘤菌的極性吸附是必需的。首先AGPs可能直接通特異的植物凝集素與根瘤菌細(xì)胞壁中葡甘聚糖[35]相互作用調(diào)控根瘤菌對(duì)豆科植物的專(zhuān)一黏附；其次，根部組織細(xì)胞釋放某些酶如水解木葡聚糖(XTH)、半乳糖苷酶[35]，參與了降解和重塑細(xì)胞壁糖蛋白和多糖。AGPs中釋放出來(lái)的寡糖可以作為誘發(fā)因子影響根瘤菌與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[36-37]，一方面可能有助于微生物的吸附，另一方面可能增強(qiáng)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。

一些非典型AGPs不僅可以誘導(dǎo)土壤微生物在宿主根表面的極性吸附，而且在根瘤結(jié)節(jié)形成的早期階段也發(fā)揮作用。叢枝真菌黏附到宿主根表面可以誘導(dǎo)宿主根瘤蛋白基因ENOD11的表達(dá)，ENOD11是細(xì)胞壁中富含脯胺酸的蛋白，它可以改變細(xì)胞壁的彈性，有利于根瘤的形成[38-39]。根際共生菌主要通過(guò)影響宿主根中的侵入線(xiàn)或者調(diào)控侵入線(xiàn)本身的發(fā)育，最終導(dǎo)致豆科根瘤的形成。單克隆抗體MAC265免疫定位表明，該抗體識(shí)別的嵌合AGPs-AGPE定位于宿主根表面和侵入線(xiàn)部位，而共生缺陷突變體出現(xiàn)異常定位，分布在細(xì)胞內(nèi)的小囊泡中，因此，MAC265抗體識(shí)別的AGPs靶向分泌與宿主根中侵入線(xiàn)發(fā)育密切相關(guān)[40]。

在發(fā)病機(jī)制方面，很少證據(jù)顯示根表面的AGPs起作用。然而，HRGPs(hydroxyproline-rich glycoproteins)和伸展蛋白(extensin)已被證實(shí)可能參與植物防衛(wèi)機(jī)制，通過(guò)對(duì)冬瓜抗性和敏感植株在病理?xiàng)l件下HRGPs和AGPs的免疫定位證實(shí)，沒(méi)有感染時(shí)，抗性植株比敏感植株更多表達(dá)伸展蛋白相關(guān)的表面抗原，而感染后，敏感植物的表皮細(xì)胞中伸展蛋白相關(guān)的表面抗原顯著性降低，抗性植株卻沒(méi)有變化，單克隆抗體CCRC-M7識(shí)別的AGPs有助于植物的抗性[34]。最近，在土豆根系分泌物的研究中，用黑脛病(Pectobacteriumatrosepticum)獲到的誘導(dǎo)子處理土豆根系，LM2和JIM15識(shí)別的AGPs表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步檢測(cè)表明AGPs糖基側(cè)鏈中的Gal含量達(dá)68.7%，而JIM13識(shí)別的AGPs沒(méi)有檢測(cè)到[41]。除了AGPs表達(dá)增強(qiáng)外，伸展蛋白的表達(dá)和修飾發(fā)生了改變[41]。在香蕉中也證實(shí)了伸展蛋白和AGPs參與了香蕉枯萎病菌的防衛(wèi)反應(yīng)[42]。其他富含賴(lài)氨酸的AGPs，如LeAGP-1和NaAGP4也對(duì)傷害和病原菌攻擊引起反應(yīng)，NaAGP4在葉片受到灰霉菌感染后表達(dá)受到抑制，相反伸展蛋白過(guò)表達(dá)，使得依賴(lài)伸展蛋白的細(xì)胞壁產(chǎn)生交聯(lián)或加強(qiáng)起到防衛(wèi)作用[41,43]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

近幾十年來(lái)，關(guān)于AGPs的研究進(jìn)展使人們對(duì)細(xì)胞質(zhì)外體中這類(lèi)糖蛋白的生物學(xué)功能有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。然而，由于AGPs糖基側(cè)鏈的高度異質(zhì)性，不同的糖基修飾賦予蛋白不同的功能，如何理解不同AG 糖基側(cè)鏈的分子結(jié)構(gòu)和糖基側(cè)鏈形成與其功能適應(yīng)是將來(lái)研究的巨大挑戰(zhàn)。同時(shí)這些AG糖基可被糖苷酶水解成各種寡糖殘基，這些釋放的寡聚糖又是如何作為潛在的因子參與哪些信號(hào)通路控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，AGPs作為植物根際分泌物的成分，相關(guān)的研究也表明了AGPs在調(diào)控植物根與微生物相互作用過(guò)程扮演重要角色，AGPs在多種益生菌與根細(xì)胞感染接觸處高效表達(dá)，它可能作為某種結(jié)構(gòu)成分或者信號(hào)分子有助于根細(xì)胞與共生體之間的物質(zhì)交換。但是，AGPs參與這種相互作用的機(jī)制是什么？來(lái)源于給定物種的AGPs是否只僅僅有效作用于自身的天然微生物天敵？AGPs又是如何精確抑制或刺激微生物群落的成員等這些問(wèn)題，仍需要我們?nèi)セ卮?。這也為AGPs的生物學(xué)功能研究開(kāi)拓了新的研究方向。

未來(lái)，隨著越來(lái)越多的物種全基因組測(cè)序完成，通過(guò)大數(shù)據(jù)利用生物信息學(xué)的方法，可以有助于我們了解AG糖基化的信息，結(jié)合遺傳學(xué)和分子生物學(xué)手段，這將有助于我們解析AGPs糖基化修飾過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明AGPs生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。