魯 軍， 李 剛， 趙建寧， 楊殿林， 修偉明

(1. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心， 天津 300191；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 沈陽 110866)

自從1994年轉(zhuǎn)基因番茄在美國第一次商品化種植以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為推動農(nóng)業(yè)科技和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要技術(shù)，轉(zhuǎn)基因作物(Genetically modified crops，GMC)由此得到了迅速發(fā)展[1]。GMC誕生以來種植面積不斷擴(kuò)大，種植品種不斷增多，已經(jīng)對傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)生了巨大沖擊。1996—2016年的這20年間，全世界GMC的播種總面積連年大幅增加，已達(dá)21億km2[2]。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)帶來巨大變革，但是其食用安全和環(huán)境安全卻受到了普遍關(guān)注[3-4]。全球很多國家和國際組織制定了一系列與轉(zhuǎn)基因相關(guān)的法律法規(guī)，甚至對含有一定轉(zhuǎn)基因成分或來源轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的商品施行不同轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度[5-7]，以此保證消費(fèi)者的選擇權(quán)和知情權(quán)。目前，用于轉(zhuǎn)基因成分檢測的技術(shù)大致可劃分為兩種：一是對核酸進(jìn)行檢測，該檢測技術(shù)主要包括定性PCR、定量PCR、巢式PCR、數(shù)字PCR、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片、Southern印記雜交和Nouthern印記雜交；二是對外源蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，該檢測技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、蛋白質(zhì)印跡法、試紙條法?，F(xiàn)有基于核酸與外源蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)都存在一些局限性，如通量低、檢測時間長、成本高、需要特殊的儀器設(shè)備等。因此發(fā)展便捷、高效、低成本、高通量的檢測技術(shù)，是保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必要條件。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，GMC及其衍生產(chǎn)品越來越多，采用傳統(tǒng)普通PCR檢測方法已經(jīng)不能達(dá)到同時檢測GMC多基因多品種的需求。相比之下，正是由于多重PCR(Multiplex PCR)技術(shù)具有傳統(tǒng)PCR不可比擬的優(yōu)勢，因而Multiplex PCR技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因成分識別和檢測中發(fā)揮著重要作用。本文對Multiplex PCR在轉(zhuǎn)基因成分不同檢測需求方面的應(yīng)用以及與其他技術(shù)相結(jié)合的最新進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并提出了持續(xù)改進(jìn)的策略。

1 Multiplex PCR關(guān)鍵技術(shù)要素

Multiplex PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來。由于Multiplex PCR是在同一個PCR反應(yīng)體系中加入了多對特異性引物，對多個目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，因此與普通PCR相比，實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的難度也成倍增加。Multiplex PCR檢測體系并不是將多個單重PCR檢測體系進(jìn)行簡單的疊加而成，而是需要在多方面分析檢測目的片段的基礎(chǔ)上，對Multiplex PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)、優(yōu)化、驗(yàn)證，獲得最優(yōu)反應(yīng)體系。以下幾個技術(shù)要素對于Multiplex PCR檢測體系尤為重要：

1)Multiplex PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段的選擇。必須有高度特異性，片段長度要有明顯的差異，建議片段長度不超過400 bp；便于后續(xù)進(jìn)行鑒別[8-9]。2)Multiplex PCR引物設(shè)計。必須有高度特異性，彼此無同源性，單條引物的長度一般為18～25個堿基，引物中4種堿基的比例要適當(dāng)，G+C含量一般為40%～60%[10-11]。3)TaqDNA聚合酶的反應(yīng)濃度。Multiplex PCR是多個擴(kuò)增反應(yīng)同時進(jìn)行，各個擴(kuò)增反應(yīng)之間會相互競爭TaqDNA聚合酶，因而擴(kuò)增效率相對較低的擴(kuò)增反應(yīng)將會受到抑制，添加適量濃度的TaqDNA聚合酶可以有效地減弱抑制作用[12]。4)反應(yīng)體系引物終濃度。篩選出最優(yōu)引物終濃度組合至關(guān)重要，可一定程度上保證各擴(kuò)增反應(yīng)的效率相近。5)退火溫度。通常退火溫度比模板-引物解鏈溫度(Tm)要低5℃～10℃。

2 Multiplex PCR在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

2.1 Multiplex PCR對通用元件的檢測

由于不同GMC所使用的外源基因和篩選元件的種類和次數(shù)各不相同，如果按通常僅檢測CaMV35S啟動子和NOS終止子的策略進(jìn)行檢測，很容易出現(xiàn)漏檢和誤檢的情況[13]。因此，為了更好地保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好在轉(zhuǎn)基因成分檢測過程中同時針對多個外源基因和篩選元件進(jìn)行檢測。

Singh等[14]以CaMV35S啟動子、CaMV35S終止子、NOS終止子、PAT、NPTII、Adh1、Sad1為檢測目標(biāo)，建立了轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因棉花的Multiplex PCR檢測方法，對已經(jīng)批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因玉米的檢測，檢出率可達(dá)93%和94%，檢出限分別為0.25%和0.5%。尹全等[15]以CaMV35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS為檢測參數(shù)建立了轉(zhuǎn)基因大豆Multiplex PCR檢測方法，檢測的靈敏度不低于1 ng。李憶等[16]以CruA、T-CaMV35S、P-CaMV35S、PAT為檢測靶標(biāo)通過對引物終濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了轉(zhuǎn)基因油菜Multiplex PCR檢測方法。尹全等[17]還以PMI、CaMV35S啟動子、RACT1啟動子、NOS終止子、BAR、PAT等6個參數(shù)為檢測目標(biāo)建立了轉(zhuǎn)基因玉米的Multiplex PCR檢測方法。張欣等[18]以G10evo-EPSPs、cry1Ab/cry2Aj、cry1Ie為檢測靶標(biāo)，建立了轉(zhuǎn)基因玉米Multiplex PCR檢測方法。陳貞等[19]還以Sad1、GUS、Cry1Ab/Ac、NPTII、CaMV35S啟動子、NOS終止子為檢測目標(biāo)，建立了轉(zhuǎn)基因棉花Multiplex PCR檢測方法，此檢測方法只需一顆棉籽就可檢測出轉(zhuǎn)基因成分。魏霜等[20]建立了基于SPS、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、Btc、GUS、NOS終止子、CaMV35S啟動子的七重PCR檢測方法，能有效檢測出水稻、大豆、玉米、棉花籽、菜籽粕中的轉(zhuǎn)基因成分。

2.2 Multiplex PCR技術(shù)對基因特異性的檢測

基因特異性檢測是以外源基因?yàn)闄z測靶標(biāo)進(jìn)行特異性檢測。目前以轉(zhuǎn)基因植物中的抗蟲基因和耐除草劑基因?yàn)榘袠?biāo)，應(yīng)用Multiplex PCR技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測的比較多，而針對抗病毒基因、抗逆基因和品質(zhì)改良基因檢測方面的研究則相對較少。

Guo等[21]建立了以Cry1Ab、Cry3A、Cry1Ac、Cry1A(b/c)、Cry3Bb1、PAT、CP4-EPSPS、BAR等基因?yàn)榘袠?biāo)的Multiplex PCR檢測方法，檢出限約為80個拷貝。李飛武等[22]應(yīng)用普通PCR與Multiplex PCR技術(shù)檢測含有Bt基因的GMC，結(jié)果表明所采用的兩種方法都可準(zhǔn)確的檢測出所檢樣品中含有的Bt基因成分。Ao等[23]建立了適用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻中CP4-EPSPS、Cry1A(b)、BAR、PAT基因檢測的多重巢式PCR方法，檢測靈敏度為0.005%。

2.3 Multiplex PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)化事件特異性的檢測

在轉(zhuǎn)基因成分檢測過程中，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測是針對外源插入基因和宿主DNA之間連接區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行檢測，較基因特異性檢測和構(gòu)建特異性檢測具有更高的特異性[24]。轉(zhuǎn)化事件特異性檢測已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測[25-26]。

Kim等[27]建立了針對轉(zhuǎn)基因玉米MON863、MON810、T25、TC6275、DAS59122-7、NK603、TC1507、MON89034、MIR162、BT176、3272、MIR604、MON88017、BT11、LY038、GA21的Multiplex PCR檢測方法，可用于食品和飼料中轉(zhuǎn)基因成分的檢測，檢出限為0.25%。李會等[28]以轉(zhuǎn)基因玉米MON863、BT176、MON810、NK603為檢測對象，建立并完善了四重 PCR檢測方法，該方法能有效檢測出4種轉(zhuǎn)基因玉米，與普通PCR方法相比，所產(chǎn)生的廢液可減少75%，檢測時間可縮短63%，檢測成本可降低75%。尹全等[29]以轉(zhuǎn)基因玉米BT11、MON810、BT176、MON863等為檢測對象，建立了Multiplex PCR檢測方法，檢測靈敏度為100個拷貝。董立明等[30]以轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、GTS40-3-2、CV127、305423、356043為檢測對象，建立了Multiplex PCR檢測方法，檢測靈敏度為0.1%。Lu等[31]和Wang等[32]以轉(zhuǎn)基因水稻KF6、KMD1、TT51-1為檢測對象，建立了Multiplex PCR檢測方法，檢出限為0.1%。Kim等[33]建立了轉(zhuǎn)基因棉花MON88913、MON1445、LLcotton25、MON15985的Multiplex PCR檢測方法，該多重體系的檢出限為1%。魯軍等[34]以轉(zhuǎn)基因油菜RF1、MS8、Topas19/2、Oxy235、RF3建立了Multiplex PCR檢測方法，其檢出限為0.05%。

通過比較可發(fā)現(xiàn)，Multiplex PCR的檢出限與普通PCR相近，但Multiplex PCR檢測的成本更低、通量更高、節(jié)省實(shí)驗(yàn)樣品和試劑，對于檢測多參數(shù)、大批量或珍貴的實(shí)驗(yàn)樣品更具有優(yōu)勢?？赏茰yMultiplex PCR技術(shù)在未來的轉(zhuǎn)基因成分檢測過程中將發(fā)揮更重要的作用。

3 Multiplex PCR與其他技術(shù)的有效結(jié)合

將Multiplex PCR技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，可將轉(zhuǎn)基因成分檢測的靈敏性和特異性提高，也可大大縮短檢測時間。

3.1 多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)是將高通量的Multiplex PCR技術(shù)與高靈敏度的實(shí)時熒光PCR技術(shù)整合在一起的技術(shù)。此技術(shù)是將多條特異性引物加到實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系中，實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測GMC及其衍生產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分[35]。目前，多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)已在轉(zhuǎn)基因成分檢測中得到驗(yàn)證和應(yīng)用，其操作簡單、重復(fù)性好、快速高效、通量高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、減少交叉污染與環(huán)境污染、自動化程度高、既可定量分析又可定性分析。

K?ppel等[36]針對FMV啟動子、CaMV35S啟動子、NOS終止子、CaMV35S終止子、PAT、CP4-EPSPS、CPT2開發(fā)了2個多重實(shí)時熒光PCR檢測體系，檢出限達(dá)到0.1%。Huber等[37]以CaMV35S啟動子、NOS終止子、BAR、PAT、CTP2-CP4EPSPS等參數(shù)為靶標(biāo)，建立了多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，檢出限為20個拷貝。Samson等[38]以轉(zhuǎn)基因玉米MON810和GA21為材料，建立了多重實(shí)時熒光PCR檢測方法，檢出限為3個拷貝。Chaouachi等[39]建立了二重實(shí)時熒光PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235，檢出限小于5個拷貝。付偉等[40]以Lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系為檢測對象，建立了多重實(shí)時熒光PCR檢測體系，檢測靈敏度為0.01%。付偉等[41]還針對Lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆DAS81419品系開發(fā)了多重實(shí)時熒光PCR檢測體系，檢測靈敏度為0.01%。

3.2 Multiplex PCR-變性高效液相色譜技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

變性高效液相色譜(DHPLC)是在單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)[42]。DHPLC與瓊脂糖凝膠電泳相比，在檢測通量、特異性、靈敏度、結(jié)果重復(fù)率、自動化程度、檢測DNA片段長度范圍等方面更具優(yōu)勢。將Multiplex PCR技術(shù)與DHPLC方法相結(jié)合所形成的Multiplex PCR-DHPLC技術(shù)正逐漸應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因成分檢測中。

向才玉等[43]以轉(zhuǎn)基因棉花MON15985、MON531和MON1445為材料，建立了Multiplex PCR-DHPLC檢測方法。白月等[44]針對轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1品系，建立了Multiplex PCR-DHPLC檢測技術(shù)，該方法可同時對5個基因進(jìn)行檢測，靈敏度為1 ng/μL。陶然等[45]建立了轉(zhuǎn)基因大豆及其食品檢測的Multiplex PCR-DHPLC技術(shù)，此方法的檢測靈敏度為0.078 ng/μL。

3.3 多重巢式PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

巢式PCR原理是先以靶標(biāo)DNA作為第一輪擴(kuò)增反應(yīng)的模板，第二輪擴(kuò)增反應(yīng)所需要的模板來源于第一輪的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，第二輪的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的片段。多重巢式PCR技術(shù)是將巢式PCR和Multiplex PCR兩種技術(shù)相結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、通量高、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)。Ao等[23]以轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因大豆中的Cry1A(b)、CP4-EPSPS、BAR、PAT基因?yàn)榘袠?biāo)建立了多重巢式PCR方法，靈敏度可達(dá)0.005%。張明輝等[46]以Lectin、EPSPS-NOS和35S-CTP基因?yàn)榘袠?biāo)，建立了可檢測大豆深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的三重巢式PCR檢測方法。

3.4Multiplex PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis，CE)是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的一種新型液相分離技術(shù)[47]。與瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細(xì)管電泳耗時短、分辨率高、重現(xiàn)性好、無需使用致癌的EB染料。將高特異性的Multiplex PCR技術(shù)與高分離度的毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，被稱之為Multiplex PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)。

張春嬌等[48]用建立的Multiplex PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因玉米LY038、MON810和MON863，檢測耗時僅11.195 min，具有高效、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)。周穎等[49]以CaMV35S啟動子、hsp70intron1和Cry1A(b)基因?yàn)榘袠?biāo)，通過Multiplex PCR擴(kuò)增，利用毛細(xì)管電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，方法的檢出限為0.05%。

3.5 Multiplex PCR-液相芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

液相芯片技術(shù) (Suspension array, liquid chip) 是一種芯片技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)，是采用不同熒光編碼的微球作為載體來實(shí)現(xiàn)核酸雜交反應(yīng)以及配體-受體、酶-底物、抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)，通過激光對熒光報告分子和編碼微球進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)定性和定量分析[50]。與傳統(tǒng)凝膠電泳相比，液相芯片鑒定技術(shù)具有更加突出優(yōu)勢，該技術(shù)將在醫(yī)學(xué)診斷、農(nóng)業(yè)檢測、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。

黃文勝等[51]以轉(zhuǎn)基因水稻KF8、LL601、BT63、KF6、M12、KMD1、T2A-1、LL62和T1C-19為材料，建立了兩個Multiplex PCR-液相芯片檢測體系，方法的檢測靈敏度達(dá)0.1%。付凱等[52]應(yīng)用建立的Multiplex PCR-液相懸浮芯片技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)基因玉米BT11、T25、GA21、MON863、BT176、MON88017、TC1507、MON810、BVLA430101、NK603、MIR162、MON89034和MIR604，方法的檢測靈敏度達(dá)0.1%。

4 問題與對策

Multiplex PCR檢測技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、通量高、節(jié)省實(shí)驗(yàn)樣品和試劑等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是與傳統(tǒng)PCR相比Multiplex PCR更加復(fù)雜，一個擴(kuò)增體系中多個PCR反應(yīng)同時進(jìn)行，如果各技術(shù)要素沒有優(yōu)化好以及影響因素控制不當(dāng)?shù)脑?，都可能?dǎo)致特異性與靈敏度降低，甚至檢測失敗。雖然Multiplex PCR技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因成分檢測中進(jìn)行應(yīng)用，但是與轉(zhuǎn)基因成分實(shí)際檢測的需求相比，現(xiàn)有的Multiplex PCR技術(shù)仍然有很大的改善空間。主要包括如下幾個方面需要改進(jìn)：1)隨著新技術(shù)的發(fā)展和新基因的引入，Multiplex PCR反應(yīng)體系中引物對數(shù)量還需增加，最大提高檢測通量。2)根據(jù)轉(zhuǎn)基因成分檢測實(shí)驗(yàn)室的管理要求對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行功能區(qū)劃分，嚴(yán)格按照檢測流程操作，避免產(chǎn)生污染。3)為進(jìn)一步將Multiplex PCR檢測的靈敏性和特異性提高，縮短檢測時間，除了優(yōu)化改善與現(xiàn)有成熟技術(shù)的結(jié)合外，還需盡可能拓展Multiplex PCR與新技術(shù)的結(jié)合，各取所長，促進(jìn)發(fā)展。4)隨著檢測設(shè)備和聚合酶的提升，Multiplex PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)成分和反應(yīng)條件還可進(jìn)一步優(yōu)化，提高檢測效率。5)盡快將成熟穩(wěn)定的Multiplex PCR檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，規(guī)范指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因成分檢測行為。