黃曉巍，徐　巖，韓　冬，林　賀，律廣富，李曉華，曲曉波，張　冰

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心藥理實驗室，吉林 長春130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與中藥藥理教研室，吉林 長春130117；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院臨床中藥系，北京 100102)

心肌細胞損傷是冠心病等各類心臟疾病的病理基礎(chǔ)，但心肌細胞的再生能力較弱，一旦心肌受損，很難在短時間內(nèi)自行恢復(fù)心肌功能。通過干細胞分化再生心肌細胞，實現(xiàn)心肌損傷的修復(fù)是心臟功能恢復(fù)的重要途徑。心肌組織中存在成體心肌干細胞(cardiac stem cells，CSC)，CSC是目前最有希望修復(fù)心肌損傷的干細胞類型[1-2]。目前CSC的移植存在許多問題，臨床應(yīng)用受限，動員自體CSC，誘導(dǎo)其向心肌細胞分化改善心功能是比較可行的方案，許多中藥有效成分具有干細胞誘導(dǎo)劑的作用，且具有不良反應(yīng)少的特點[3-5]。鹿茸味甘、咸，性溫補陽，歸肝、腎經(jīng)，稟純陽之質(zhì)，含生發(fā)之氣，具有壯元陽、益精血、溫通心陽、滋補腎精之功效，是中醫(yī)臨床采用溫通心陽法治療冠心病的核心藥材之一[6-7]。鹿茸多肽是鹿茸的有效成分，有明顯促進細胞再生作用。本研究通過體外細胞實驗觀察鹿茸多肽介導(dǎo)CSC分化對終末心肌分化基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)和心肌肌凝蛋白輕鏈2(myosin light chain 2v，MLC-2v)表達的影響，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級新生Wistar大鼠，雄性，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(吉)2013-0001。

1.2藥品、主要試劑和儀器鹿茸多肽(長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制，批號：20150417，純度>97%)，5-氮胞苷(中國上海阿拉丁試劑有限公司，批號：B1412007，純度>98%)。胰蛋白酶(美國Sigma公司，批號：T0303)，膠原酶(北京索萊寶公司，批號：C8140)，DMEM和胎牛血清(美國Gibco公司，批號：12491-015、1009-141)，CEM培養(yǎng)基(自制，DMEM 180 mL、胎牛血清20 mL、L-谷氨酰胺2.58 mg、β-巰基乙醇1.4 μL)，瓊脂糖和DNA上樣緩沖液(上海碧云天公司，貨號：ST004L、D0071)，AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen公司，貨號：AP-UN-MS-RNA-50)，DMA Ladder、ANP Elisa kit和MLC-2v Elisa kit(上海生工生物工程有限公司，貨號：B600109、D730358、D710117)，PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物工程有限公司，貨號：RR036A、RR82LR)。CO2孵箱(日本三洋公司，型號：MCO-17)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號：IX71)，低溫離心機(德國Heraeus公司，型號：Biofuge primp R)，熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司，型號：Mx3000)，凝膠成像系統(tǒng)(美國 Aplegen公司，型號：Omegalum C)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號：Gallios)。

1.3 大鼠CSC分離提取和原代培養(yǎng)取剛出生2 d的健康Wistar大鼠的心臟于培養(yǎng)皿內(nèi)，去除結(jié)締組織并擠壓出多余的血液，用PBS多次漂洗干凈后，轉(zhuǎn)移至無菌玻璃瓶中，將其剪成大小約為1 mm×1 mm×1 mm的塊狀物，反復(fù)吹打組織塊棄去上清液，并用PBS清洗心臟組織至澄清，吸出PBS。加入0.25%胰蛋白酶(含0.20% EDAT)1 mL，消化5 min，吸棄上清液，再加入0.1%膠原酶1 mL，消化5 min；消化步驟重復(fù)3次。將消化好的心臟組織塊，靜置1 min，吸取上清液至1.5 mL離心管內(nèi)，800 r·min-1離心2 min。吸去上清液，加入CEM培養(yǎng)基1 mL，反復(fù)輕輕吹打，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.4大鼠CSC的傳代培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好的CSC，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)1～2 mL，放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2～3 min，鏡檢細胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，貼壁松弛，立即加入等量的細胞培養(yǎng)液終止消化作用，用移液器吹打培養(yǎng)瓶底，以致心肌細胞脫離瓶壁，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，800 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入細胞培養(yǎng)液，吹打成細胞懸液，轉(zhuǎn)入新的細胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

1.5c-Kit細胞免疫熒光鑒定分析取傳代培養(yǎng)狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長的CSC，PBS漂洗后，經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化后，將細胞懸液接種于24孔板中，細胞密度為1×105cm-2。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛300 μL，室溫固定20 min，PBS漂洗3次；加入山羊血清(封閉液)200 μL，室溫孵育60 min，PBS漂洗3次；加入一抗200 μL，4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，加入二抗200 μL，37℃避光孵育60 min；PBS漂洗3次，加入200 μL Hoechst33342浸染5～10 min，棄去。熒光倒置顯微鏡檢測熒光表達并拍照。采用流式細胞術(shù)檢測CSC特異性表面標(biāo)志物c-Kit和CD34的表達，以c-Kit陽性細胞表達占全部細胞百分比表示心肌干細胞純度。

1.6CSC分組和藥物誘導(dǎo)分化將傳代培養(yǎng)狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長的CSC經(jīng)胰酶消化，制成細胞密度為1×108L-1的單細胞懸液，分成12個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。藥物誘導(dǎo)細胞共分4組：空白對照組(加等量緩沖液)、5-氮胞苷(終濃度3 μmol·L-1)、鹿茸多肽組(終濃度800 mg·L-1)和聯(lián)合組(3 μmol·L-15-aza+800 mg·L-1鹿茸多肽)，各組待80%細胞貼壁后，加入相應(yīng)藥物誘導(dǎo)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.7ELISA法檢測各組細胞上清液中MLC-2v和ANP表達水平收集各組細胞上清液，按上海生工生物工程有限公司提供的ANP和MLC-2v Elisa kit說明書檢測各組細胞上清液中ANP和MLC-2v的表達水平，測定450 nm波長處吸光度(A)值。

1.8RT-PCR法檢測各組細胞中ANP和MLC-2v mRNA表達水平按AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明書提取各組細胞總RNA；然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應(yīng)條件：37℃孵育60 min，85℃孵育5 min，冰浴5 min)；再通過普通PCR擴增儀，以cDNA為模板，獲得目的基因。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、DDH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)后，72℃延伸5 min，4℃保存。內(nèi)參β-actin的引物，上游序列：5′-GTCCCTGTATGCCTCTGGTC-3′，下游序列：5′-GGTCTTTACGGTTGTCAACG3′(458 bp)；目的基因ANP的引物，上游序列：5′-TGAGCTTCCTCCTTTTACTG-3′，下游序列：5′-CTCAGCTTGCTTTTTAGGAG-3′(322 bp)；MLC-2v引物序列：上游引物5′-GCACCTAAGAAAGCAAAGAA-3′，下游引物：5′-AGGGTCAAACACTTTGAATG-3′(321 bp)。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分析，通過凝膠成像系統(tǒng)，對電泳結(jié)果進行拍照、記錄結(jié)果。以目的基因與內(nèi)參β-actin的灰度值之比表示mRNA表達水平。

2　結(jié)　果

2.1c-Kit細胞免疫熒光鑒定分析在IX71倒置熒光顯微鏡下觀察可見：c-Kit抗原偶聯(lián)的FITC呈綠色熒光表達，c-Kit抗原表達的CSC見圖1A(插頁四)；通過Hoechst33342熒光染色，染成藍色的細胞核見圖1B(插頁四)。

2.2CSC純度分析P0代細胞c-Kit陽性細胞較少、CD34陽性細胞和雜細胞相對較多，隨著細胞傳代次數(shù)增加，c-Kit陽性細胞百分比明顯升高；到P3代時，大多數(shù)細胞均為c-Kit陽性，而CD34陽性細胞和雜細胞百分比共占約4.8%，說明細胞經(jīng)過4次傳代后得到純化的CSC。見表1。

表1CSC純度分析

Cellc?KitCD34ParenchymacellsP06．23±1．3832．78±4．0860．98±6．20P113．26±2．7615．90±2．8971．84±5．45P250．83±4．255．28±1．9844．02±5．02P395．27±3．082．08±0．322．73±0．59

2.3各組細胞上清液中ANP和MCL-2v表達水平與空白對照組比較，5-氮胞苷組、鹿茸多肽組和聯(lián)合組細胞上清液中ANP 及MCL-2v表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2各組細胞上清液中ANP和MLC-2v表達水平

Tab.2Expression levels of ANP and MLC-2v in cell supernatant in various groups

GroupANPMLC?2vBlankcontrol248．63±28．3632．98±5．605?Azacytidine378．25±52．58?48．05±4．68?Piloseantlerpolypep?tides306．28±43．50?45．22±5．39?Combined422．58±50．06?58．65±6．03?

*P<0.05 compared with blank control group.

2.4各組細胞中ANP和MCL-2v mRNA表達水平與空白對照組比較，5-氮胞苷組、鹿茸多肽組和聯(lián)合組ANP 和MCL-2v mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖2和表3。

3　討　論

心肌損傷伴隨臨床多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，保護和增加心肌細胞數(shù)目對維持心肌結(jié)構(gòu)的完整和心臟功能的穩(wěn)定有積極的意義，藥物誘導(dǎo)多能干細胞分化為心肌細胞進而修復(fù)受損心肌是國內(nèi)外研究[8-10]的熱點。研究[11]表明：胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞和脂肪干細胞等在不同條件下均可誘導(dǎo)分化為心肌細胞，但存在誘導(dǎo)條件相對復(fù)雜、穩(wěn)定性差等缺點。CSC是存在于心臟中的自體心肌干細胞，在正常狀態(tài)下基本處于“休眠”狀態(tài)，一旦心肌受損或心臟功能發(fā)生病理學(xué)改變，其在短時間內(nèi)快速分化為心肌細胞，對于修復(fù)受損心肌具有重要意義[12]。

目前干細胞移植技術(shù)尚不成熟，使用適當(dāng)?shù)乃幬镎T導(dǎo)促進干細胞分化成為可行方案?；瘜W(xué)合成藥

M:DNA ladder；Lane 1:Blank control group；Lane 2:5-Aza cytidine group；Lane 3:Pilose antler polypeptides group；Lane 4:Combined group.

圖2RT-PCR法檢測各組細胞中ANP和MCL-2v mRNA表達電泳圖

Fig.2Electrophoregram of expressions of ANP and MCL-2v mRNA in cells in various groups detected by RT-PCR method

表3各組細胞中ANP 和MCL-2v mRNA表達水平

GroupANPmRNAMCL?2vmRNABlankcontrol0．53±0．130．69±0．155?Azacytidine0．77±0．11?1．10±0．24?Piloseantlerpolypep?tides0．71±0．10?0．93±0．21?Combined0．88±0．14?0．91±0．25?

*P<0.05 compared with blank control group.

如5-氮胞苷是經(jīng)典的干細胞誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)多種干細胞分化，但作為化學(xué)藥物，其具有一定的毒性，長期使用可能誘導(dǎo)細胞變異甚至死亡[13-14]。中藥單體或有效成分作為干細胞誘導(dǎo)劑與化學(xué)合成藥物相比，具有種類多、來源廣和效果明顯的特點，且少有毒性報道[15-16]。中醫(yī)臨床上治療冠心病多采用溫通心陽法，而鹿茸是核心藥材之一，鹿茸多肽是鹿茸主要藥效學(xué)物質(zhì)，具有明顯促進細胞再生作用[17]。ANP是利鈉利尿肽，為心臟循環(huán)激素，由心房心肌細胞合成、分泌，而MLC-2v特定表現(xiàn)在心室細胞中，二者在胚胎心臟發(fā)育形成過程中起很重要的作用[18-21]。

本研究結(jié)果顯示：鹿茸多肽可以明顯提高CSC中 ANP和MLC-2v 表達水平，提示其可以作為干細胞誘導(dǎo)劑促進CSC分化，且與5-氮胞苷聯(lián)合應(yīng)用可以在一定程度上降低其毒性。

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