王孝蕓，藍(lán)　楠，唐紅梅，袁謝芳，王　星，李國平

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室， 四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川 瀘州 646000 )

哮喘是當(dāng)前世界面臨的重要健康問題，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，在重癥哮喘發(fā)作時(shí)尤其明顯。如何抑制黏液高分泌成為哮喘防治需解決的關(guān)鍵問題[1]。氣道黏液是一種膠狀液體，分布于氣道表面，是氣道上皮細(xì)胞的物理屏障。然而過度的黏液分泌和黏液清除下降可導(dǎo)致黏液在氣道聚集和阻塞氣道，導(dǎo)致患者明顯咳嗽和呼吸困難，并增加患者死亡率。近年研究[2]顯示：黏液高分泌可引起氣道高反應(yīng)，阻礙炎癥的逆轉(zhuǎn)和多余黏液的清除。黏蛋白是黏液中的主要蛋白成分，是一種糖基化蛋白，其編碼基因?yàn)镸UC，迄今為止已發(fā)現(xiàn)11種黏蛋白基因(MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8，MUC13和MUC19)在肺部表達(dá)[3-4]。氣道黏蛋白主要包括MUC2、MUC4、MUC5AC和MUC5B。MUC5AC和MUC5B在氣道表達(dá)最多，尤其是MUC5AC，在氣道杯狀細(xì)胞中高表達(dá)，是黏液細(xì)胞增生和化生的標(biāo)志。輕中度哮喘患者主要產(chǎn)生富含MUC5AC黏蛋白的黏液，致死性哮喘患者明顯存在MUC5AC和MUC5B高表達(dá)[5-6]。

MUC5AC產(chǎn)生主要通過白細(xì)胞介素13(IL-13)/白細(xì)胞介素4受體α(interleukin-4 receptor α,IL-4Rα)復(fù)合物和表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)2條途徑來調(diào)節(jié)。白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)和IL-13均屬于輔助性T細(xì)胞(helper T cell)2型細(xì)胞因子(Th2)，在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，二者均通過IL-4Rα傳遞信號(hào)。IL-4R途徑與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6(signal transducers and activators of transcription 6,STAT6)活化有關(guān)。研究[7]顯示：在小鼠氣道Clara細(xì)胞中，過敏原介導(dǎo)的黏液高分泌依賴于Clara細(xì)胞的IL-4Rα信號(hào)途徑。近來研究[8]顯示：IL-4還可通過介導(dǎo)含脂筏的小窩蛋白的聚集影響人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC的合成。信號(hào)轉(zhuǎn)錄子與轉(zhuǎn)錄活化子STAT6在IL-13的活化下激活，引起MUC5AC產(chǎn)生、黏液腺化生和氣道高反應(yīng)性[7]。屋塵螨(house dust mite,HDM)在過敏性哮喘中起著重要作用，是過敏性哮喘發(fā)生的重要致敏原。研究[9]顯示:在過敏性炎癥中HDM可以破壞上皮細(xì)胞黏膜屏障并且激活T細(xì)胞，引起IL-4和IL-13等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。另有研究[10]顯示亞洲沙塵螨可引起小鼠氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC的高表達(dá)從而影響氣道黏液分泌。有研究[11]顯示：HDM可通過EGFR信號(hào)途徑破壞氣道上皮屏障功能。受體酪氨酸蛋白激酶是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)酶，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等過程中起著重要的生理病理作用。Lyn激酶是非受體酪氨酸激酶Src家族成員之一。Lyn與許多信號(hào)途徑有關(guān)，參與了哮喘炎癥與氣道重塑發(fā)生，但在哮喘發(fā)病中的具體機(jī)制不明。本研究構(gòu)建人MUC5AC啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，觀察在HDM刺激作用下Lyn激酶對(duì)MUC5AC表達(dá)的影響及Lyn對(duì)MUC5AC表達(dá)的調(diào)節(jié)是否依賴于調(diào)節(jié)STAT6途徑。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器16HBE細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶(美國MBI公司)，T4DNA連接酶、dNTP、Taq酶及buffer(中國TaKaRa公司)，高糖DMEM(中國Hyclone公司)，OPTI-MEM和胎牛血清(美國Gibco公司)，脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國Promega公司)，HDM提取液(美國GEER公司)，pRL-TK質(zhì)粒(中國百替生物公司)，BCA蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(中國Beyotime公司)，LynsiRNA、MUC5AC一抗、STAT6一抗和辣根過氧化物酶二抗(美國SantaCruz公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗(英國Abcam公司)，Western blotting化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore公司)。水平電泳儀(中國天能公司)，熒光報(bào)告檢測(cè)儀(美國Promega公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2構(gòu)建人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫確定MUC5AC基因啟動(dòng)子區(qū)域(-1300/+48)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增-1300/+48啟動(dòng)子的引物，應(yīng)用基因重組及PCR等技術(shù)，構(gòu)建人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因(pGL3-hMUC5AC/-1300/+48)。

1.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)① 用含5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于24孔板培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。細(xì)胞設(shè)PBS組和HDM組待細(xì)胞融合度為40%～50%時(shí)，用LynsiRNA分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組和HDM組細(xì)胞。待細(xì)胞繼續(xù)生長至融合度為80%～90%時(shí)，用Invitrogen脂質(zhì)體2000試劑盒將pGL3-hMUC5AC/-1300/+48和pRL-TK二質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至16HBE細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟如下：a.用50 μL OPti-MEM培養(yǎng)基稀釋相應(yīng)的DNA或者RNA；b.用50 μL OPti-MEM稀釋適量的脂質(zhì)體，室溫靜置5 min；c.稀釋的DNA或RNA和脂質(zhì)體混勻，室溫靜置20 min；d.將混合物加至24孔板，輕輕吹勻，前后搖動(dòng)24孔板。② 棄掉舊培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。加不含抗生素和血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并用1 μg·L-1的 HDM提取液刺激轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞24 h，然后采用Promega雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)16HBE細(xì)胞中pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的相對(duì)熒光素酶活性(relative luciferase unit,RLU)。RLU=RLU1/RLU2,RLU1為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2為內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。

1.4免疫熒光法檢測(cè)16HBE細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)水平① 用共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，分為LynsiRNA轉(zhuǎn)染組和非LynsiRNA轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞融合度為40%～50%時(shí)，用Invitrogen脂質(zhì)體2000試劑盒進(jìn)行LynsiRNA轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)(轉(zhuǎn)染方法如前所述)。轉(zhuǎn)染4 h后換含血清的新鮮DMEM。采用濃度為1 μg·L-1的HDM刺激細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組。② 加4%多聚甲醛固定30 min，用0.2%Triton穿孔15 min，PBS漂洗2次，每次5 min；用1%BSA封閉30 min；加抗MUC5AC抗體(1∶100)于4℃孵育過夜，PBS漂洗；加FITC標(biāo)

記的二抗(1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，在Leica共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)水平。MUC5AC表達(dá)水平以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，采用Leica共聚焦顯微鏡自帶軟件分析。

1.5Western blotting檢測(cè)16HBE細(xì)胞中STAT6表達(dá)水平① 用60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，分為LynsiRNA轉(zhuǎn)染組和非LynsiRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染步驟按Invitrogen脂質(zhì)體2000試劑盒說明操作，轉(zhuǎn)染4 h后換含血清的新鮮DMEM。用濃度為1 μg·L-1的HDM分別刺激LynsiRNA干擾組和非LynsiRNA干擾組細(xì)胞24 h，并設(shè)PBS對(duì)照組。② 去除培養(yǎng)液，PBS漂洗，每個(gè)培養(yǎng)皿加300 μL Western blotting及IP細(xì)胞裂解液和3 μL的PMSF，冰上靜置5 min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管并離心10 min(4℃、12 000 r·min-1)。將上清液轉(zhuǎn)移到新EP管，加5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，冷卻后-20℃保存。③ 用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度；配制10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每孔加20 μg蛋白樣品；100 V恒壓垂直電泳90 min；將分離的蛋白用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為100 mA恒流轉(zhuǎn)膜4 h；用5%的脫脂奶粉封閉膜上非特異性位點(diǎn)，封閉時(shí)間為1 h；分別加內(nèi)參β-actin和STAT6一抗(1∶200)，4℃孵育過夜；用TBST緩沖液漂洗2次，每次10 min；加相應(yīng)的二抗(1∶800)，室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗如前；最后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光液，采用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc Touch 成像系統(tǒng)曝光成像。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶的相對(duì)灰度值(以β-actin為內(nèi)參)，以STAT6/β-actin表示STAT6表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1pGL3-MUC5AC/-1300/+48載體構(gòu)建將pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48片段亞克隆至pGL3-enhance載體，陽性克隆經(jīng)KnpⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1300/+48片段帶和約5 000 bp的載體帶。見圖1。

Lane 1: DNA marker; Lane 2: pGL3-MUC5AC/-1300/+48; M: DNA marker 2 000 bp plus.

圖1pGL3-MUC5AC/-1300/+48酶切鑒定

Fig.1Identification of pGL3-MUC5AC/-1300/+48 with restriction enzyme digestion

2.2pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的RLUHDM組pGL3-hMUC5AC/-1300/+48基因的RLU高于PBS組(PBS組：4.210±0.036；HDM組：7.030±0.176)(P<0.05)；LynsiRNA干擾HDM組細(xì)胞后，RLU明顯升高(HDM組：7.030±0.176；HDM LynsiRNA組：10.080±0.442)(P<0.05)。

2.3各組16HBE細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)水平采用濃度為1 μg·L-1的 HDM刺激16HBE細(xì)胞24 h后，采用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)水平，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見圖2(插頁一)。HDM組16HBE細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)水平高于PBS組(PBS組:29.480±1.581; HDM組：66.700±2.780)(P<0.05)；LynsiRNA干擾HDM組細(xì)胞后，其MUC5AC表達(dá)水平高于未干擾時(shí)(HDM組：66.70±2.78；HDM LynsiRNA組:93.61±2.65)(P<0.05)。

2.4各組16HBE細(xì)胞中STAT6表達(dá)水平采用Western blotting法檢測(cè)HDM刺激下人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)中STAT6的表達(dá)水平。LynsiRNA干擾后HDM組細(xì)胞中STAT6表達(dá)水平(118.98±1.77)高于未干擾時(shí)(88.23±2.04)(P<0.05)。見圖3。

Lane 1:PBS group; Lane 2:PBS+LynsiRNA group; Lane 3:HDM group; Lane 4:HDM+LynsiRNA group.

圖3Western blotting法檢測(cè)各組16HBE細(xì)胞中STAT6表達(dá)電泳圖

Fig.3Electrophorogram of expressions of STAT6 in 16HBE cells in various groups detected by Western blotting method

3　討　論

氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，抑制氣道黏液高分泌是防治哮喘、尤其是嚴(yán)重哮喘的關(guān)鍵[12-13]。黏蛋白是黏液中的主要蛋白成分，其編碼基因?yàn)轲さ鞍谆騇UC，迄今為止已發(fā)現(xiàn)11種黏蛋白基因。已有研究[6,14]顯示：MUC5AC在氣道中表達(dá)最多，對(duì)氣道黏液高分泌有重要作用,因此對(duì)MUC5AC基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究對(duì)于臨床治療哮喘有重要意義。氣道黏液高分泌與IL-4和IL-13等Th2型細(xì)胞因子相關(guān)，主要通過IL-4Rα途徑傳遞信號(hào)。IL-4Rα途徑與STAT6活化密切相關(guān)。IL-4Rα途徑可激活JAK3、JAK2 和TYK2等激酶，從而使STAT6磷酸化。磷酸化的STAT6二聚體向核遷移并與IL-4和IL-13啟動(dòng)子結(jié)合，由此影響Th2細(xì)胞分化，引起氣道高反應(yīng)和氣道黏液高分泌[7,15]。HDM是過敏性哮喘的重要致敏原，研究[16]顯示約有50%的哮喘患者對(duì)HDM變應(yīng)原過敏。有研究[9,17]顯示：HDM可破壞氣道上皮屏障，并激活T細(xì)胞，引起IL-4和IL-13等細(xì)胞因子的釋放，發(fā)生以Th2型為主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。另有研究[10]顯示：亞洲沙塵螨可引起小鼠氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC的高表達(dá)從而影響氣道黏液分泌。但有關(guān)HDM和MUC5AC之間關(guān)系的研究還很少。本研究采用濃度為1 μg·L-1的重組HDM提取液刺激人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：HDM可引起人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC的高表達(dá)，說明HDM可誘導(dǎo)氣道黏液高分泌。Lyn屬于Src家族，是一種非受體酪氨酸激酶，在除了T淋巴細(xì)胞以外的造血細(xì)胞上表達(dá)，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)酶，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等過程中起著重要的生理病理作用。有研究[18]顯示：Lyn對(duì)造血干細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和血小板等具有正向和負(fù)向的雙重調(diào)節(jié)作用。Lyn缺陷小鼠容易發(fā)生骨髓增生和免疫性疾病。Lyn基因敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重和持續(xù)的變態(tài)反應(yīng)炎癥、血清IgE水平升高和Th2免疫應(yīng)答表明：Lyn激酶可能是一個(gè)重要的陰性調(diào)節(jié)Th2免疫應(yīng)答的激酶，但其具體調(diào)節(jié)作用不明[19]。有研究[20]顯示IL-13可通過STAT6-TMEM16A-ERK1/2途徑引起MUC5AC高表達(dá)。也有研究[21]顯示Rho激酶抑制劑法舒地爾可通過調(diào)節(jié)STAT6和NF-κB減輕過敏性氣道炎癥和下調(diào)MUC5AC的表達(dá)。這些研究結(jié)果皆提示STAT6在MUC5AC表達(dá)中起著重要作用。本研究采用LynsiRNA抑制Lyn在人支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)采用1 μg·L-1的重組HDM提取液刺激LynsiRNA干擾的人支氣管上皮細(xì)胞和正常對(duì)照上皮細(xì)胞。雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：采用LynsiRNA干擾人支氣管上皮細(xì)胞后，MUC5AC表達(dá)要高于正常對(duì)照細(xì)胞，說明Lyn缺失可增加人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)。而Western blotting檢測(cè)結(jié)果也提示Lyn缺失可能通過上調(diào)STAT6的水平增加人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)。

本研究說明Lyn和人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)有關(guān)，Lyn缺失可通過上調(diào)STAT6的水平而增加人支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)。本研究結(jié)果對(duì)闡明Lyn在哮喘氣道黏液高分泌作用機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有重要作用。

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