董興軍 吳立華 王尚武

(湖北省潛江市皮膚病醫(yī)院檢驗科，潛江 433100)

直接鏡檢是淺部真菌形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，也是最簡單、快速、實用的實驗室診斷方法。尤其是甲真菌感染患者病情頑固，易傳播和交叉感染，給患者帶來很大心里壓力，臨床需要準(zhǔn)確診斷，及時治療。本實驗用乳酸酚棉藍染液法和熒光染色法[1]對同一患者的同一部位標(biāo)本同時進行鏡檢，比較這兩種方法的鏡檢陽性率。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

取自本院皮膚科門診患者，擬診為甲真菌感染者。其中男145例，女135例，共280例。取材部位：指甲152例，趾甲128例。

1.2 方法

取材 用75%酒精在皮損處消毒，取活動性邊緣的甲屑，趾 (指)甲取病甲下或近端甲屑，同時采集2份標(biāo)本放置2張玻片上送檢。

乳酸酚棉藍染色法 染液配制方法：石碳酸20 mL，乳酸20 mL，甘油40 mL，蒸餾水20 mL，稍加熱溶解，然后加入棉藍50 mg，混勻，過濾即可。將標(biāo)本置于玻片上，滴加一滴染液，覆上蓋玻片，輕壓使標(biāo)本平鋪5 min后鏡檢。

真菌熒光染色液 由南京漢瑞生物科技有限公司提供。主要成份：氫氧化鉀、水溶性熒光增白劑、純化水。制片同上。

器材 奧林巴斯CX31普通光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯CX23熒光顯微鏡。

鏡檢 固定由兩位具有多年工作經(jīng)驗的檢驗師進行全片觀察，以發(fā)現(xiàn)多個孢子或菌絲判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，兩樣本率比較采用χ2檢驗，組間率的兩兩比較采用分割χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對280例患者，每例同時采集兩份標(biāo)本到兩塊玻片上，分別進行熒光染色法 (280份)及乳酸酚棉藍染色法 (280份)直接鏡檢，以高倍鏡下觀察到菌絲或孢子判定為陽性。結(jié)果見表1。不同部位的菌絲在兩種方法中的形態(tài)見圖1～4。

乳酸酚棉藍染色法直接鏡檢，趾甲部、指甲部陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.17，P>0.05)。熒光染色法直接鏡檢，趾甲部、指甲部陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.06，P>0.05)，其中趾甲部用兩種方法鏡檢，陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=15.52，P<0.05)；指甲部用兩種方法鏡檢，陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=13.12，P<0.05)。

3 討 論

皮膚癬菌是常見的真菌感染性皮膚病，其基本形態(tài)分為菌絲和孢子兩種，取樣直接鏡檢見到一定數(shù)量的菌絲或孢子，即可確定有真菌感染存在[2]。張宏等[3]根據(jù)真菌結(jié)構(gòu)和感染部位指出乳酸酚棉藍染色法可用于淺部真菌的直接鏡檢，這種方法取材簡單，操作方便。用乳酸酚棉藍染色后直接鏡檢，鏡下菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚易辨，背景干凈、清晰，反差大，孢子染色后呈圓形或橢圓形,易于分辨[4]。

表1 不同部位兩種方法鏡檢結(jié)果情況 (n，%)

圖1趾甲標(biāo)本：乳酸酚棉藍染色，×40圖2趾甲標(biāo)本：熒光染色，×40圖3指甲標(biāo)本：乳酸酚棉藍染色，×40圖4指甲標(biāo)本：熒光染色，×40

Fig.1Toenail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.2Toenail specimens:fluorescent staining,×40Fig.3Nail specimens: lactophenol cotton blue stain,×40Fig.4Nail specimens: fluorescent staining,×40

但不能對角質(zhì)細胞起溶解作用，角質(zhì)層細胞和菌絲同時被染成淡藍色，特別在菌絲或孢子較少時更不易看到，由于真菌生長環(huán)境的因素，菌絲染色很淡，仔細才能看見。熒光染色法通過特殊熒光素與組織中可能存在的真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合[5]，在紫外光的激發(fā)下，可使真菌顯示熒光。在熒光顯微鏡特定的激發(fā)光波段下 (340～400 nm),菌絲或孢子發(fā)出明亮的藍綠色熒光，在黑暗的背景下特別顯影，根據(jù)典型的菌絲橫隔和出芽結(jié)構(gòu)，非常便于識別。有一些纖維素也能被熒光著色，但沒有菌絲那樣分枝的管狀結(jié)構(gòu)，容易區(qū)分。標(biāo)本經(jīng)過熒光染色后，孢子呈明亮的圓形、橢圓形，有的長出芽胞，對脂肪滴不產(chǎn)生標(biāo)記，與脂肪滴易于鑒別[6]，熒光染液還有KOH成份，能對組織細胞起溶解作用，使組織透明化，提高鏡檢陽性率。兩種方法鏡檢甲真菌結(jié)果顯示，熒光染色法優(yōu)于乳酸酚棉藍染色法 (χ2=28.44，P<0.05)，正確選擇取樣部位和足夠的標(biāo)本量，耐心細致地觀察全片，結(jié)合臨床癥狀，就能夠提高鏡檢工作效率和準(zhǔn)確率，但真菌菌種的明確仍需依賴真菌培養(yǎng)及鑒定。

[1] 劉運德，樓永良，王躍，等. 微生物學(xué)檢驗[M].第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：360-363.

[2] 帥麗華，宋秋荷，孫曉紅.兩種浮載液真菌直接鏡檢效果比較[J].中國真菌學(xué)雜志,2008,3(6):343-346.

[3] 張宏，廖萬清，郭寧如，等.真菌感染的實驗室診斷.實用臨床真菌病學(xué)[M].第1版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2009:10-13.

[4] 黃霞云，劉晶杰.真菌染色新方法的探索[J].實用醫(yī)技雜志,2006,13(11)：1862-1863.

[5] 張宏，吳紹熙.深部真菌病快速診斷的新實驗方法[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊,1995，21(1):12-14.

[6] 韓德忞, 劉原志,朱均昊，等.熒光染色法與KOH濕片法在真菌直接鏡檢中的應(yīng)用比較[J].中國真菌學(xué)雜志,2016，11(4):240-243.