馮錦麗　王衛(wèi)

腦卒中是全球腦死率和嚴(yán)重長(zhǎng)期殘疾的主要原因之一，預(yù)計(jì)到2030年將增加24.9%[1]。由于其多個(gè)潛在危險(xiǎn)因素引起的疾病的復(fù)雜性阻礙了該疾病的診斷和潛在的治療。在過(guò)去幾十年中影像學(xué)檢查如CT、MRI都有助于腦卒中的早期診斷及治療。腦梗死的早期準(zhǔn)確診斷對(duì)于臨床治療至關(guān)重要，并將大大改善預(yù)后。然而，與心肌梗死等疾病相比，腦梗死的早期診斷和預(yù)后評(píng)估常常受到極大的限制[2]。已有部分研究將一些生物標(biāo)志物如C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等作為輔助診斷腦梗死的工具，但其特異性以及區(qū)分ACI及其相關(guān)危險(xiǎn)因素的能力有很大的局限性[3]。目前仍然缺乏ACI診斷及預(yù)后評(píng)估的敏感的生物標(biāo)志物，有關(guān)ACI診斷和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)需要進(jìn)一步的研究。

隨著基因芯片技術(shù)鑒定RNA生物標(biāo)志物的方法的出現(xiàn)，可以對(duì)細(xì)胞、組織或血液中提取的RNA針對(duì)特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測(cè)。基因表達(dá)的變化反映在腦梗死患者外周血RNA中。通過(guò)血液mRNA基因表達(dá)譜可以區(qū)分短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，進(jìn)一步了解TIA原因，腦卒中風(fēng)險(xiǎn)和其他TIA病理生理學(xué)信息[4]。血液mRNA基因表達(dá)譜可作為腦卒中的基因組生物標(biāo)志物，甚至是作為腦卒中亞型的特征[5-6]。

miRNA是一類22個(gè)核苷酸，短的非編碼RNA分子，通過(guò)與靶向mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程。除了細(xì)胞間分布外，miRNA在所有類型的體液中普遍存在。由于其組織特異性、相對(duì)穩(wěn)定性和體液豐度，miRNA被認(rèn)為是組織損傷的敏感的血漿生物標(biāo)志物[7]。miRNA是腦的發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)因子，miRNA的變化與腦卒中發(fā)生的高危因素、神經(jīng)元死亡、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞和腦水腫形成等有關(guān)[8]。腦梗死后腦組織和血液中表現(xiàn)出特異性的miRNA表達(dá)[9]。此外，循環(huán)miRNA表達(dá)在腦卒中患者以及不同腦卒中亞型中差異很大，因此循環(huán)miRNA表現(xiàn)出發(fā)展成缺血性腦卒中生物標(biāo)志物的潛力[10]。

作為特異性的腦miRNA，miR-124是成人和胚胎腦中最豐富的miRNA。然而，miR-124在腦缺血中的確切機(jī)制未知。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠血漿miR-124在腦缺血后6 h顯著升高，中腦動(dòng)脈閉塞建模后48h仍保持高水平，表明其作為腦梗死的生物標(biāo)志物的潛在作用[11]。本研究旨在觀察ACI患者 miR-124水平的變化，并對(duì)循環(huán)miR-124水平的變化與腦梗死體積、NIHSS評(píng)分之間的關(guān)系進(jìn)行分析，為miR-124在腦卒中的潛在應(yīng)用價(jià)值提供了一定的參考依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年4月～2016年12月在本科住院的ACI患者90例，其中男57例，女33例，年齡 47～78歲，平均年齡(58.9±10.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合1995年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，并經(jīng)頭顱CT、MRI掃描證實(shí)；②首次發(fā)病，發(fā)病72h內(nèi)入院；③經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期有感染、發(fā)熱、腦外傷等疾病患者；②短暫性腦缺血發(fā)作或合并腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等疾?。虎塾袗盒阅[瘤、嚴(yán)重心肝腎疾病、血液系統(tǒng)等疾病患者。另選取同時(shí)期體檢健康者40例作為對(duì)照組，其中男23例，女17例，年齡40～63歲，平均年齡(56.3±9.4)歲。2組年齡、性別及體質(zhì)指數(shù)(BMI)比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，具有可比性。

表1　2組受試者一般資料比較

1.2方法

1.2.1分組根據(jù)發(fā)病后3～7 d的頭部CT計(jì)算腦梗死體積，按Pullicino等[13]公式:梗死體積(cm3)=π/6×長(zhǎng)×寬×CT掃描陽(yáng)性層數(shù)，根據(jù)腦梗死體積將ACI患者分為3個(gè)亞組：小梗死組(<5 cm3，n=38)，中梗死組(5～10 cm3，n=31)，大梗死組(>10 cm3，n=21)；根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分，將ACI患者分為3個(gè)亞組：輕度組(≤6分，n=30)、中度組(7～14分，n=34)、重度組(≥15分，n=26)。

1.2.2循環(huán)miR-124表達(dá)水平檢測(cè)患者于住院次日，體檢健康者于體檢當(dāng)日晨起空腹采集靜脈血，加入到乙二胺四乙酸(EDTA)處理的抗凝血管中，3000 r/min離心10 min后分離血漿，然后再以12000 r/min離心10 min分離血漿，置于無(wú)RNA酶的Ep管中，置于-80 ℃冰箱保存，集中待測(cè)。操作步驟為①RNA提?。喊凑誱irVana PARIS試劑盒說(shuō)明書(ABI公司，美國(guó))分離總RNA。通過(guò)用RNase Free水洗滌，收集總RNA(100 μL)，然后使用NanoDrop ND-1000核酸定量檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度和純度(NanoDrop公司，美國(guó))；②qRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄引物為miR-124，5'-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-CGGCATT-3'；U6，5'-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。按照TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(Ambion公司，美國(guó))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，定量檢測(cè)血漿樣品中microRNA。用于PCR的引物設(shè)計(jì)為miR-124，前向5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'，反向5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAG CACATATACT-3'，反向5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。qPCR在7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進(jìn)行。U6snRNA用于標(biāo)準(zhǔn)化miRNA的表達(dá)。Ct值是指樣品管的熒光信號(hào)達(dá)到某一固定閾值的PCR反應(yīng)循環(huán)周期數(shù)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-124的相對(duì)表達(dá)水平。

2　結(jié)　果

2.1各組循環(huán)miR-124的表達(dá)水平比較觀察組miR-124相對(duì)表達(dá)水平(2.93±1.21)明顯高于對(duì)照組(1.09±0.55)(t=10.198，P<0.01)。

2.2不同腦梗死體積組miR-124的表達(dá)水平比較不同腦梗死體積3個(gè)亞組間miR-124相對(duì)表達(dá)水平比較有明顯差異(F=20.963，P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，小梗死組miR-124相對(duì)表達(dá)水平明顯高于中、大梗死組(P均<0.01)，中梗死組miR-124相對(duì)表達(dá)水平明顯高于大梗死組(P<0.01)(圖1)。相關(guān)性分析顯示，miR-124相對(duì)表達(dá)水平與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān)(r=-0.577，P<0.01)(圖2)。

圖1　不同梗死體積組miR?124相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2　miR?124表達(dá)水平與腦梗死體積的相關(guān)性分析

2.3不同NIHSS評(píng)分組患者miR-124的表達(dá)水平比較不同NIHSS評(píng)分3個(gè)亞組間miR-124相對(duì)表達(dá)水平比較無(wú)明顯差異(F=1.170，P>0.05)(圖3)。

圖3　不同NIHSS評(píng)分組miR?124相對(duì)表達(dá)水平比較

3　討　論

腦卒中是一種威脅人類健康和生命的重大腦血管病，發(fā)病率、殘疾率和病死率均較高。急性腦缺血可能引發(fā)一系列瀑布式病理生理學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自由基損傷、神經(jīng)元凋亡等，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)缺血區(qū)神經(jīng)元死亡。本研究旨在找到有效的生物標(biāo)志物用于早期診斷缺血性腦卒中，對(duì)于及時(shí)有效的治療和改善預(yù)后具有重要意義。已有研究認(rèn)為，腦特異性miR-124可作為腦組織損傷診斷敏感性的循環(huán)生物標(biāo)志物[7]。

miR-124是在除垂體腺以外的所有腦區(qū)域中高度特異性表達(dá)的miRNA，參與干細(xì)胞調(diào)節(jié)和神經(jīng)發(fā)育[14-15]。miR-124在各種細(xì)胞和組織類型中顯示特定的時(shí)間和空間分布，并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛的生物學(xué)功能。Hamzei等[16]研究表明在大腦中腦動(dòng)脈閉塞小鼠模型中外源性給予miR-124可以起到保護(hù)神經(jīng)和抗炎作用，減少神經(jīng)元凋亡，miR-124可作為腦卒中發(fā)作時(shí)神經(jīng)保護(hù)和功能恢復(fù)的新型治療策略。Laterza等[7]研究發(fā)現(xiàn)制作腦梗死大鼠模型后8 h大鼠血漿miR-124表達(dá)水平升高，產(chǎn)生腦損傷，24 h達(dá)到峰值。Weng等[11]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死大鼠模型中血漿miR-124表達(dá)水平在6 h顯著升高，48 h后仍然保持高水平，表明血漿miR-124可以作為候選生物標(biāo)志物用于腦梗死的早期檢測(cè)。在動(dòng)物模型中miR-124已經(jīng)被提出作為缺血性腦損傷的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，ACI患者循環(huán)miR-124相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高。本研究推測(cè)，miR-124從梗死的腦組織中釋放入血，可能在腦缺血中起到重要的保護(hù)作用。miR-124在體內(nèi)缺血應(yīng)激反應(yīng)中顯著升高，可能是一種保護(hù)性反應(yīng)。

miR-124在腦缺血中的作用尚不明確，可能具有多重和復(fù)雜的作用。Sun等[17]研究顯示，與大腦中腦動(dòng)脈閉塞小鼠的非缺血區(qū)相比，缺血半暗帶區(qū)miR-124表達(dá)水平顯著增加，而敲除miR-124顯著增加了小鼠的梗死面積。在體外miR-124促進(jìn)了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，從而有效減少神經(jīng)元凋亡，這說(shuō)明miR-124通過(guò)凋亡抑制途徑在缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。Doeppner等[18]研究顯示病毒載體介導(dǎo)的miR-124可減少腦損傷和功能障礙，增強(qiáng)神經(jīng)血管重塑。miR-124通過(guò)RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)降解在缺血條件下促進(jìn)神經(jīng)元存活。因此，異位miR-124表達(dá)作為腦卒中治療中一個(gè)新穎的思路。然而，也有報(bào)道m(xù)iR-124對(duì)于腦卒中治療不相一致的結(jié)果。Zhu等[19]研究顯示敲除大腦miR-124可以減少神經(jīng)元死亡和梗死面積，減輕腦組織損傷。另外，Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)盡管miR-124模擬物在局部腦缺血24 h后不影響腦梗死體積，但是由于iASPP表達(dá)上調(diào)，miR-124的抑制有效地減輕了缺血性腦損傷。miR-124在缺血性腦卒中的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的闡明。

目前血漿miR-124與ACI患者腦梗死面積、神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度之間的關(guān)系尚無(wú)一致的結(jié)論。Ji等[21]對(duì)血清外來(lái)體miR-124在急性缺血性腦卒中(AIS)診斷和損傷評(píng)估的價(jià)值進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AIS患者血清外來(lái)體miR-124的中值水平明顯升高，與NIHSS評(píng)分、梗死體積和IL-6血清濃度均呈正相關(guān)，外來(lái)體miR-124的AUC值為0.6976。這表明miR-124可能是診斷AIS和評(píng)估由缺血性腦損傷引起的神經(jīng)功能腦損傷程度的潛在生物標(biāo)志物。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)血清miR-124在急性缺血性腦卒中發(fā)生后24h內(nèi)顯著降低，miR-124水平與ACI患者梗死體積和血漿高敏C反應(yīng)蛋白水平呈負(fù)相關(guān)。這表明血清miR-124在急性缺血性腦卒中被抑制，從而促進(jìn)神經(jīng)炎癥和腦損傷。本研究為了評(píng)估腦梗死急性期miR-124的診斷價(jià)值，分析了miR-124表達(dá)水平與梗死體積和NIHSS評(píng)分的關(guān)系，結(jié)果顯示ACI患者梗死體積越大，miR-124相對(duì)表達(dá)水平越低，miR-124水平與腦梗死體積存在顯著負(fù)相關(guān)，這與之前Liu的研究報(bào)道[23]相一致，而miR-124水平與NIHSS 評(píng)分無(wú)明顯關(guān)系。

由于miR-124在缺血性腦卒中的復(fù)雜性，除了ACI患者自身遺傳、社會(huì)特征外，樣本量大小、單個(gè)中心研究甚至取樣時(shí)間的不同等因素都有可能影響研究結(jié)果。這就需要擴(kuò)大樣本量、多中心研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。本研究不足之處在于未能對(duì)miR-124在ACI發(fā)病過(guò)程中表達(dá)水平的變化進(jìn)行系統(tǒng)的觀察，以期了解治療前后循環(huán)miR-124水平的變化以及對(duì)于預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。此外，未來(lái)的研究工作還將對(duì)miR-124與炎癥因子之間的關(guān)系做進(jìn)一步研究分析，了解miR-124在缺血性腦卒中中抗炎/促炎的角色。

綜上所述，在腦梗死急性期循環(huán)miR-124表達(dá)水平明顯增高，且其與腦梗死體積大小密切相關(guān)。

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