陳小蘭 劉海平 余豐 陳文芳 蘇晞 高平明

地中海貧血是由于一種或多種珠蛋白肽鏈合成受阻或抑制，導(dǎo)致血紅蛋白組分異常，從而引起的溶血性貧血，是一種遺傳性溶血性疾病[1]。根據(jù)合成障礙肽鏈的不同，主要分為α地中海貧血和β地中海貧血兩大類。世界上不同國家發(fā)病率大約在1%～10%，在地中海地區(qū)某些國家發(fā)病率高達(dá)10%[2,3]。在中國，華南地區(qū)如廣東、廣西等地中海貧血高發(fā)，而佛山也為地中海貧血高發(fā)區(qū)域之一。為避免或減少再次出生中間型和重型地中海貧血，及早發(fā)現(xiàn)和治療地中海貧血患兒，本中心從去年開始開展全市地中海貧血篩查。為探討本地區(qū)地中海貧血篩查及基因型分布情況，以及Hb Bart's 帶含量對α-地中海貧血分型的價值，現(xiàn)對本市2016年1月—2016年9月的地中海貧血篩查及基因確診情況報道如下。

對象與方法

1.研究對象

于2016年1月—2016年9月，以佛山市婦幼保健網(wǎng)為平臺，募集在廣東省佛山市各產(chǎn)科醫(yī)院出生的新生兒，采集新生兒足底末梢血，用血紅蛋白電泳法做初篩檢測?；灸技瘲l件如下：(1)佛山市四區(qū)(禪城區(qū)、南海區(qū)、三水區(qū)和高明區(qū))出生。(2)新生兒家屬知情同意。

經(jīng)血紅蛋白電泳法初篩陽性者，我們將其召回。召回復(fù)檢的新生兒經(jīng)家屬知情同意后，采集新生兒靜脈血做地中海貧血基因檢測以確診。

2.方法

(1)主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

Capillarys2全自動毛細(xì)管電泳儀(法國Sebia公司)；緩沖液、溶血素、沖洗液和正常HbA2質(zhì)控品等(法國Sebia公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司，icycler)；α地貧基因檢測試劑盒和β地貧基因檢測試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)；DNA快速提取試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)。

(2)標(biāo)本采集和保存

采血時間為新生兒出生后2～7 d。采集血片標(biāo)本前，護(hù)士向家長解讀新生兒疾病篩查告知書并經(jīng)家屬知情同意，且完整填寫采血卡片，按照采血規(guī)范進(jìn)行操作。采集新生兒足底末梢血，滴在濾紙片上，血片采集完成后，于4 ℃冰箱保存。初篩陽性者召回做基因檢測者，抽取新生兒靜脈血2 ml 于EDTA抗凝管中，于4 ℃冰箱保存。

(3)全自動血紅蛋白電泳檢測方法

采集的血片經(jīng)打孔制成試驗(yàn)用直徑為3.2 mm的血斑，用蒸餾水浸泡血斑后，須于2～72 h內(nèi)用全自動毛細(xì)管電泳儀上機(jī)檢測。首先，讀取樣品架及樣品試管的條形碼，然后用溶血素稀釋樣本，每次稀釋后要清洗取樣針，再清洗毛細(xì)管，稀釋后的樣本注入毛細(xì)管，然后在穩(wěn)定恒壓下進(jìn)行電泳，在415 nm波長下檢測血紅蛋白(Hb)各組分百分比。HbA2帶和部分Hb Bart's帶須手動識別。

(4)地中海貧血的基因診斷方法

采用DNA快速提取試劑盒提取全血DNA后，在PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，α地貧基因采用α地貧基因檢測試劑盒，β地貧基因采用β地貧基因檢測試劑盒，按照操作說明書進(jìn)行。缺失型α地貧基因采用Gap-PCR技術(shù)法檢測，非缺失型α地貧基因和β地貧基因采用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)法(RDB)檢測。

(5)診斷標(biāo)準(zhǔn)和定義

①初篩陽性

出現(xiàn)Hb Bart's帶，即為初篩α地中海貧血陽性。出現(xiàn)HbE帶即初篩β地中海貧血陽性，或者根據(jù)HbA帶、HbA2帶及HbA/HbA2比值綜合判定是否為初篩β地中海貧血陽性。

②確診陽性

-α4.2/αα、-α3.7/αα、αCSα/αα、αWSα/αα和αQSα/αα為靜止型α地中海貧血， -α3.7/-α3.7、-α3.7/αQSα、--SEA/αα為輕型α地中海貧血，-α4.2/--SEA、--SEA/αCSα、--SEA/αWSα、-α3.7/--SEA為中間型α地中海貧血，--SEA/--SEA為Hb Bart's 水腫。

-28/N、-29/N、IVS-II-654/N、βE/N、CD41-42/N、CD17/N、CD71-72/N、CD43/N、CD14-15/N、CD27-28/N為輕型β地中海貧血。

-α3.7/αα & CD17/N、--SEA/αα & CD41-42/N、-α3.7/αα & IVS-II-654/N、-α3.7/αα & CD41-42/N和-α3.7/αα & βE/N為α合并β輕型地中海貧血。

(6)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和率表示。

結(jié)果

1.新生兒人群基本特征

2016年1月—2016年9月募集在佛山市出生的新生兒共28 491名，經(jīng)血紅蛋白電泳法初篩陽性者3 824名,初篩陽性率13.4%。我們對初篩陽性者進(jìn)行召回，復(fù)采血樣的新生兒有1 040名，召回成功率27.2%。

復(fù)采血樣的1 040名新生兒中，拒絕地中海貧血基因診斷者400名，最終同意做地中海貧血基因診斷的新生兒640名。其中，男性365名，占57.0%，女性275名，占43.0%，出生地區(qū)主要為禪城區(qū)和南海區(qū)，其中禪城區(qū)289名，占45.2%，南海區(qū)330名，占51.6%，三水區(qū)18名，占2.8%，高明區(qū)3名，占0.5%。如表1所示。

表1 新生兒人群的基本特征(n=640)

2.新生兒地中海貧血基因確診情況及基因型特征

α地中海貧血初篩確診符合率88.1%(421/478)，β地中海貧血初篩確診符合率65.7%(111/169)。初篩陽性者中進(jìn)行地中海貧血基因診斷的新生兒640名，確診陽性523名，確診陽性率81.7%。

其中，靜止型α地中海貧血201名，占38.4%，主要基因型為-α3.7/αα(63.7%)。輕型α地中海貧血197名，占37.7%，主要基因型為--SEA/αα(98.5%)。中間型α地中海貧血17名，占3.3%，主要基因型為--SEA/-α3.7(47.1%)。輕型β地中海貧血98名，占18.7%，主要基因型為CD41-42/N(49.0%)。α合并β輕型地中海貧血10名，占1.9%，主要基因型為--SEA/αα & CD41-42/N(50.0%)。初篩懷疑β輕型地中海貧血但不排除α地中海貧血者，選擇做基因確診的有158例，最后確診為α合并β輕型地中海貧血的為4例，占2.5%(4/158)。見表2。

3.不同Hb Bart's含量確診陽性率和確診的α地中海貧血分型

Hb bart's含量為0.1%的共有45例，確診陽性數(shù)24例，確診陽性率53.3%，其中，靜止型α地中海貧血占95.8%，輕型地中海貧血僅1例。Hb bart's含量為0.2%的共有72例，確診陽性數(shù)62例，確診陽性率86.1%，均為靜止型α地中海貧血。Hb bart's含量為0.3%的共有56例，確診陽性數(shù)50例，確診陽性率89.3%，也均為靜止型α地中海貧血。Hb bart's含量為0.4%～1%的共有73例，確診陽性數(shù)64例，確診陽性率87.7%，90.6%為靜止型α地中海貧血，9.4%為輕型α地中海貧血。Hb bart's含量為1%～5%的共有213例，確診陽性數(shù)202例，確診陽性率94.8%，4.5%為靜止型α地中海貧血，95.0%為輕型α地中海貧血，僅有1例為中間型α地中海貧血(Hb bart's為3.8%)。Hb bart's含量為5%～20%的共有19例，確診陽性率100.0%，15.8%為輕型α地中海貧血，84.2%為中間型α地中海貧血。如表3所示。

表2 確診地中海貧血基因型分布情況

注：a：靜止型地中海貧血部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失

討論

地中海貧血是我國華南地區(qū)重點(diǎn)防治的一種單基因遺傳病。不同分型的地中海貧血患者可有不同的臨床表現(xiàn)，靜止型和輕型患者可無明顯的貧血癥狀，因此極易漏診，中間型地中海貧血患者需終身輸血，重型α地中海貧血會引起胎兒水腫綜合征而無法存活，而重型β地中海貧血表現(xiàn)為嚴(yán)重溶血性貧血，多于未成年夭折。地中海貧血發(fā)病率高，是一個重大的公共衛(wèi)生問題，同時也給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

表3 Hb bart's帶含量及確診的α地中海貧血類型

本研究擬通過對全市地中海貧血篩查及基因診斷情況進(jìn)行分析，以了解本市新生兒地中海貧血的基因型特征，以及探討Hb Bart's 帶含量尤其是臨界值對α-地中海貧血分型的價值和意義，為地中海貧血健康教育以及實(shí)驗(yàn)室檢測輔助診斷提供理論參考依據(jù)，從而指導(dǎo)合理婚配，預(yù)防和減少中間型及重型地中海貧血患兒的出生。本研究統(tǒng)計(jì)，佛山市地中海貧血初篩陽性率為13.4%，稍高于廣東茂名(12.5%)和廣西玉林(11.89%)[4,5]，稍低于廣東梅州(13.75%)和重慶地區(qū)(13.92%)[6,7]，總體處于較高的水平。本次研究結(jié)果顯示，召回成功率僅為27.2%，分析可能的原因有，首先，成功召回做基因診斷者出生地區(qū)主要為南海區(qū)和禪城區(qū)，可能是由于南海區(qū)和禪城區(qū)距離醫(yī)院較近，三水區(qū)和高明區(qū)距離較遠(yuǎn)，因此召回成功率相對低。其次，召回力度可能相對不足，中心召回初篩陽性者方法是通過系統(tǒng)發(fā)送短信通知家長帶小孩回中心做基因確診，短信回復(fù)收到者則不再進(jìn)行電話通知，短信未回復(fù)者再電話通知一次。只有中間型及重型地中海貧血患兒才會緊急召回，多次電話通知，直至患兒回中心或在其他醫(yī)院確診。此外，部分初篩陽性者選擇在其他醫(yī)院做地中海貧血基因確診，而本中心并未知曉，導(dǎo)致召回成功率相對偏低。另外，部分采血卡片上新生兒家長電話填寫有誤，導(dǎo)致很難通知到患兒。

研究顯示，α地中海貧血確診符合率明顯高于β地中海貧血，本研究的α地中海貧血確診符合率(88.1%)稍低于南寧地區(qū)(94.16%)，而β地中海貧血確診符合率(65.7%)高于南寧地區(qū)報道(41.10%)[8]。南寧這項(xiàng)研究中，β地中海貧血是以HbA<9.4%作為初篩陽性的標(biāo)準(zhǔn)，假陽性可能較高，而本次研究是根據(jù)HbA、HbA2及HbA/HbA2比值綜合判定，假陽性率相對較低。本次研究中，檢出主要為靜止型α地中海貧血(主要基因型-α3.7/αα)和輕型α地中海貧血(主要基因型--SEA/αα)，且檢出基因均為常見性，未發(fā)現(xiàn)罕見的基因型，該結(jié)果與廣東廣西等地區(qū)文獻(xiàn)報道類似[9,10]。

在地中海貧血初篩檢測中，一般來說，Hb bart's含量在0.3%及以下的基本需手動識別，尤其是臨界值0.1%肉眼相對較難識別，本次研究結(jié)果中，Hb bart's含量為0.1%的確診陽性率僅為53.3%，假陽性率相對較高，因此，臨界值的初篩結(jié)果判定須謹(jǐn)慎，具體分型還需基因確診。研究結(jié)果顯示，Hb bart's含量低于1%，90%以上均為靜止型α地中海貧血，Hb bart's含量1%～5%，95%為輕型α地中海貧血，Hb bart's含量高于5%,80%以上為中間型α地中海貧血，表明Hb bart's含量更高，提示地中海貧血分型可能更重，但是具體分型仍然須行基因診斷確診。

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