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1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.重慶市萬州區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶 404100；3.貴州省公共資源交易中心，貴州 貴陽 550004

苦參是豆科植物苦參SophoraflavercensAit.的干燥根[1]。一般在春天和秋天采挖，去除掉苦參的根頭及小支根，洗干凈，干燥后趁鮮切片。可用于熱痢、黃疸尿閉、便血、赤白帶下、陰腫陰癢、皮膚瘙癢、濕疹、外治滴蟲性陰道炎等病癥，是我國的常用傳統(tǒng)中藥材。由于中藥材大多都是生藥，多附有泥土或其他異物，或有異味、有毒性、潮濕等不宜于保存，經(jīng)過一定的炮制處理，可以達到使藥物純凈、矯味、降低毒性和干燥而不變質(zhì)，加強藥物效用的目的，減除毒性或副作用，便于儲存和便于服用[2-4]。筆者對苦參藥材的不同炮制方法進行研究并測定苦參生物堿含量，采用高效液相色譜法對苦參藥材提取物的5種不同生物堿進行分離及用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件進行圖譜對比，為苦參不同炮制原理及炮制品質(zhì)量評價提供合理的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 METTLERTOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AS系列超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Q-250B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；HH-Z數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州奧華儀器有限公司)；DROGON移液槍(上海恒奇有限公司)；Agilent1200高效液相色譜儀(LC-2010c)，G1314B VWD檢測器，“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(A版)數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 藥品和試劑 苦參根采購于藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥用植物與生藥學教研室常楚瑞副教授鑒定為苦參SophoraflavercensAit.的干燥根；苦參堿(批號：110805-200508)、氧化苦參堿(批號：110780-201007)、槐定堿標準品(批號：110784-200804)購自中國食品藥品檢定研究院；槐果堿(批號：Z25A16L17029)、氧化槐果堿(批號：Z18S6B3547)標準品購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、乙醇為色譜純，水為自制超純水；甲醇、磷酸、三氯甲烷等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿對照品，用甲醇溶解并制成含槐果堿0.02288 mg/mL、苦參堿0.0832 mg/mL、氧化苦參堿0.4912 mg/mL、槐定堿0.1044 mg/mL、氧化槐果堿0.3762 mg/mL的對照品儲備液。

2.2 炮制方法 S1生品：取苦參藥材150 g，用粉碎機打成細粉，過3號篩(60目)后封存。

S2炒黃品：取苦參生品150 g，置于熱鍋中，用文火炒至較原色加深時，取出稱量得143.4 g，打成細粉，過3號篩(60目)后封存?zhèn)溆谩?/p>

S3炒焦品：稱取150 g苦參生品，置于熱鍋中，用文火加熱，不斷翻炒，炒至藥物表面焦褐色并具有焦香氣，取出稱量得135.8 g，打成粉末，過3號篩(60目)后封存。

S4炒炭品：稱取150 g苦參置于熱鍋中，用武火加熱，不斷翻動，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色時，取出稱量得123.0 g，打成粉末，過3號篩(60目)后封存。

S5醋炙品：按照苦參：醋(5∶1，g/v)，取苦參150 g，加醋拌勻，悶透，待醋被吸進盡后，取出稱量得200.0 g，置于熱鍋內(nèi)，用文火炒至微干，取出干燥，打成細粉，過3號篩(60目)后封存。

S6酒炙品：按照苦參：酒(3∶1，g/v)，取150 g苦參片加酒攪拌，使藥材全部悶透，待酒被吸進盡后，取出稱量得190.4 g，置于熱鍋中炒干，打成細粉，過3號篩(60目)后封存。

S7麩炒品：按照苦參：麩皮片(1∶4，g/g)，稱取200 g麩皮，撒于熱鍋中，加熱至冒煙時，放入50 g苦參片，迅速翻動，炒至藥材表面顏色變深時，溢出焦香氣，取出篩去麩皮后稱量得45.8 g，打成細粉，過3號篩(60目)后封存。

S8蒸炙品：取150 g苦參片置于蒸制容器里隔水加熱，蒸6 h后取出干燥，打成細粉，過3號篩(60目)后封存。

2.3 供試品溶液的配制 分別取苦參的不同炮制品約0.3 g，精密稱重后加到具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液1 mL，加入三氯甲烷20 mL。塞上瓶塞，進行超聲處理(功率250 w，頻率33 kHZ)30 min，取出冷卻至室溫，補足重量至20mL，搖勻，過濾，精密量濾液5 mL，經(jīng)2 g的無水硫酸鈉過濾，取續(xù)濾液在85℃水浴鍋蒸干，用甲醇溶解定容到10 mL，備用。

2.4 紫外分光光度法測定苦參炮制品生物總堿含量與分析

2.4.1 線性考察 用微量進樣器精密吸取苦參堿對照品溶液0、100、150、200、250、300 μL分別加入25 mL具塞試管中，85℃水浴蒸干，加入溴麝香草酚藍緩沖液6 mL(pH=7.6)+CHCl36 mL，振搖，分層，以對照品溶液0 mL加入溴麝香草酚藍緩沖液6 mL(pH=7.6)+CHCl36 mL試管為空白，在416 nm波長處測定其吸光度。求出回歸方程。結(jié)果得到苦參總堿濃度A與吸光度X關系曲線的回歸方程A=0.05629X-0.00356，相關系數(shù)r2=0.9993。結(jié)果表明本實驗苦參堿在2.55～6.8 μg/mL有良好的線性關系。

2.4.2 精密度實驗 分別取苦參堿對照品100 μL加到5個25 mL具塞試管中，同2.4.1項下方法進行測定其吸光度，連續(xù)測得5次，結(jié)果平均RSD為0.68%。

2.4.3 重復性實驗 精密稱定同一樣品苦參粉末 6份分別為：0.3003、0.3006、0.3009、0.3004、0.3005 g，同2.3項下提取苦參生物總堿，同2.4.1項下方法進行測定其吸光度，生物總堿平均含量為0.3430 mg/g，RSD為0.97%。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 精密稱定供試品的溶液，每隔30 min測定一次，持續(xù)4 h，生物總堿平均含量為0.3421 mg/g，計算得其RSD為1.9%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.5 炮制品苦參生物堿含量測定 吸取苦參總堿提取物100 μL，按照2.4.1測定吸光度，樣品結(jié)果見表1。 從表1得出苦參炮制品中各生物總堿含量大小為：炒炭品<醋炙品<蒸制品<炒黃品<炒焦品<生品<酒炙品<麩炒品，說明苦參不同炮制方法對苦參藥材提取物的生物總堿有影響，且麩炒品的苦參生物總堿含量最高，酒炙品次之。

表1 不同炮制品生物總堿含量

2.6 苦參炮制品HPLC指紋圖譜方法學考察

2.6.1 色譜條件 Agilent1200 Inertsil NH2色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動相-乙腈-無水乙醇-3%磷酸(84∶10∶6)；檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/mim；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.6.2 精密度試驗 取供試品溶液20 μL，按照2.2.1色譜條件，連續(xù)進樣5次，結(jié)果5個主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均不大于1.39%，符合色譜峰指紋圖譜要求，精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液20 μL，按照2.2.1色譜條件，分別在0、2、4、8、10 h檢測指紋圖譜，結(jié)果5個主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均不大于2.47%，符合色譜峰指紋圖譜要求，表明10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性好。

2.6.4 重復性試驗 取同一炮制品5份，精密稱定0.3002、0.3007、0.3004、0.3001、0.3006 g按照2.3供試品方法制備溶液，按照2.6.1色譜條件，結(jié)果5個主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均不大于1.97%，符合色譜峰指紋圖譜要求，表明該方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

2.6.5 苦參炮制品HPLC指紋圖譜構(gòu)建與分析 幾種苦參炮制品按“2.3”的方法制備供試品溶液，測定指紋圖譜，圖2為某一樣品(酒炙品)在60 min的HPLC圖譜，共有11個峰，色譜分離度較好。將幾種苦參炮制品的指紋圖譜數(shù)據(jù)按照中位數(shù)對照圖譜生成方法導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，參照圖譜為S1，選取時間窗寬度為0.3 min，采用中位數(shù)法計算，選定5個特征峰進行多點校正，自動匹配，生成的對照圖譜R，通過圖譜的比較，確定11個色譜峰為共有峰，圖3為不同炮制品的HPLC指紋圖譜。

不同炮制品的5個生物堿的相對保留時間和相對峰面積為表2、表3，5個對照品HPLC圖譜見圖4和不同苦參炮制品HPLC指紋圖譜見圖3。炒炭品1號峰為槐果堿和2號峰為苦參堿的峰面積較大，且出現(xiàn)了g1和g2的色譜峰；以及炒焦品的3號峰為氧化槐果堿和5號峰為氧化苦參堿的峰面積較大。表明炮制品中炒炭品1號(槐果堿)和2號(苦參堿)含量均增加；炒焦品中3號(氧化槐果堿)和5號峰(氧化苦參堿)含量均增加，共有峰的相對保留時間RSD均小于1.50%，符合指紋圖譜要求。峰面積RSD為27%～154.52%，炮制品間5種生物堿的量有較大變化。

表2 苦參炮制品5種生物堿的相對保留時間

表3 苦參炮制品5種生物堿的相對峰面積

將生品和幾種苦參炮制品的指紋圖譜數(shù)據(jù)按照平均數(shù)對照圖譜生成方法導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，自動匹配成功后生成對照圖譜(見圖2)，進行相似度評價，將S1定為1.000，得出不同苦參炮制方法的指紋圖譜相似度見表4。炮制品中炒炭品相似度為0.385%，其它炮制品相似度均大于0.720%，說明各批次間炮制品相似度差異較大。

表4 苦參不同炮制品指紋圖譜相似度 (%)

3 討論

采用紫外分光光度法進行總生物堿含量測定，苦參生物總堿含量結(jié)果顯示麩炒品含量最高，認為苦參用輔料麩皮炒后利于生物堿的提取，炒炭品比生品含量低，可能由于溫度過高又會使它生物堿含量被破壞。

不同苦參炮制品HPLC指紋圖譜中，S4炒焦品出現(xiàn)g1和g2峰，認為炒炭品有些化學成分會增加，具體出現(xiàn)了哪些化學成分的變化，尚有待進一步研究。

在HPLC指紋圖譜研究過程中，各色譜圖基線相對平穩(wěn)，各個炮制品色譜峰分離良好，并且各峰面積較為適宜。本文考察了苦參炮制品指紋圖譜研究，利用指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件進行對比分析各個炮制品間的圖譜比較，其中炒炭品相似度相對較小。結(jié)果表明苦參生品及7種炮制品之間指紋圖譜存在一定差異，主要表現(xiàn)在化學成分含量的增加或者減少，說明苦參不同炮制方法對其含主要化學成分只有量變無質(zhì)變影響。因此，本試驗可以為苦參炮制工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

綜上，苦參生品及7種炮制品之間指紋圖譜存在一定差異，主要表現(xiàn)在化學成分含量的增加或者減少。參中主要生物堿成分差異不大，但其量有變化，炮制品的品質(zhì)不一致，此方法較全面地反應苦參不同炮制品的差異,可用于評價苦參炮制品的質(zhì)量。

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