劉荷英，王 輝，季洪健，姚秋菊

(上海解放軍第85醫(yī)院呼吸內(nèi)科 200052)

肺癌是對(duì)人類健康與生命危害最大的一種惡性腫瘤，也是惡性腫瘤的首位死因，約占惡性腫瘤死因的30%[1]。其中，約80%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌，盡管手術(shù)、放療、化療和靶向治療技術(shù)在不斷地提高，但是NSCLC的總體5年生存率仍小于16%[2-3]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類長(zhǎng)21～25個(gè)核苷酸的具有非編碼功能的小RNA。miRNAs通過(guò)降解靶基因mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯在腫瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其可能扮演著原癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲、凋亡和耐藥調(diào)節(jié)等諸多角色[4]。

近年來(lái)對(duì)miRNA在肺癌中作用的研究逐漸成為了一個(gè)熱點(diǎn)，這對(duì)未來(lái)肺癌的診斷和治療帶來(lái)了廣闊的前景[5-7]。諸多研究表明，miR-107在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌和肺癌中均表達(dá)下調(diào)[8-12]。同時(shí)研究還指出，過(guò)表達(dá)miR-107能夠靶向腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)間接調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。也有研究[12]指出，miR-107通過(guò)靶向CDK8增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，但是對(duì)于miR-107調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期的具體機(jī)制目前還尚未有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道。

本課題首先在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株中上調(diào)miR-107水平研究其對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響，然后構(gòu)建含預(yù)測(cè)靶基因 3′-非編碼區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)的質(zhì)粒行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-107與下游靶基因的結(jié)合位點(diǎn)，并用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot檢測(cè)miR-107對(duì)靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)的影響，最后檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中沉默靶基因的表達(dá)后對(duì)A549細(xì)胞增殖和周期的影響。本課題初步探討了miR-107在肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的可能作用及其機(jī)制，為后續(xù)基于miRNA的肺癌臨床生物治療的新靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；miR-107模擬物、抑制模擬物和陰性對(duì)照模擬物(上海吉瑪公司)；小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和陰性對(duì)照siRNA(上海銳博生物)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；青-鏈霉素(上海吉諾生物科技有限公司)；TRIzol和lipofectamine2000(美國(guó)Invitrogen公司)；噻唑藍(lán)(MTT)和碘化丙錠(PI,美國(guó)Sigma公司)；二甲基亞砜和結(jié)晶紫(申能博彩生物技術(shù)有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；抗體細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1)和β-actin(美國(guó)Abcam公司)；Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；FCASCalibur 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；7900HT熒光定量?jī)x(美國(guó)ABI公司)；Odyssey蛋白分析成像系統(tǒng)(美國(guó)LICOR公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) A549和HEK293T細(xì)胞加含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞按每孔3×105接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)細(xì)胞融合度為40%～50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照l(shuí)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5 h后換成正常培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組：脂質(zhì)體+miR-107模擬物過(guò)表達(dá)組(OV-miR-107組)，脂質(zhì)體+miR-107抑制模擬物下調(diào)組(KD-miR-107組)和脂質(zhì)體+陰性對(duì)照模擬物組(NC組)。siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同上，3條CCNE1的siRNA靶序列分別為siRNA-1：5′-CGC ACG AGA TCT ACG ACA T-3′，siRNA-2：5′-ACA ATC GGA TGA TGA TTA A-3′，siRNA-3：5′-GCA GCA GCA TCT AGT ACC T-3′。

1.2.2實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 按照Trizol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞中總RNA。參照Takara公司PrimeScript RT-PCR kit說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。CCNE1上游引物5′-TTT CAG GGT ATC AGT GGT G-3′，下游引物5′-ACA TGG CTT TCT TTG CTC-3′；GAPDH上游引物5′-AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT-3′,下游引物5′-CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；94 ℃繪制熔解曲線。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，所有樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組A549細(xì)胞消化重懸計(jì)數(shù)，以每孔5 000個(gè)分別接種入96孔板。然后分別于24、48、72、96和120 h進(jìn)行如下操作：每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量490 nm處各孔的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染36 h后細(xì)胞消化重懸離心，每管計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞， PBS洗滌2次；加入預(yù)冷70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜；離心去上清，PBS清洗后加入0.05 g/L PI 50 μL，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 應(yīng)用在線生物信息預(yù)測(cè)軟件對(duì)hsa-miR-107可能作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇的原則是該基因具有物種保守性。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-107 靶向結(jié)合CCNE1 3′-UTR。構(gòu)建含有CCNE1 3′-UTR的psiCHECK-2載體質(zhì)粒。將HEK293T細(xì)胞接種于12孔板上，細(xì)胞密度為80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組：質(zhì)粒+miR-107模擬物+脂質(zhì)體(miR-107組)；質(zhì)粒+NC模擬物+脂質(zhì)體(NC組)。轉(zhuǎn)染30 h后終止培養(yǎng)，PBS洗2次，每孔細(xì)胞加入100 μL的裂解緩沖液，室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液于干凈的EP管中；在白色不透光的96孔板加入20 μL樣品，加入100 μL的LARⅡ液，立刻測(cè)熒光值；將板拿出，繼續(xù)在孔中加入100 μL Stop Glo Reagent液，迅速吹打均勻，再測(cè)值。最后將所得到的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行分析。

1.2.6Western blot檢測(cè)CCNE1蛋白表達(dá) 將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗滌2次，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白。取每孔20 μg蛋白進(jìn)行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAG)，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的單克隆抗體CCNE1和β-actin(內(nèi)參照)抗體，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；PBST洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫反應(yīng)30 min；PBST 洗膜3次，應(yīng)用Odyssey激光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，OV-miR-107組較KD-miR-107組和NC組明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.05)，濃度25～100 nmol/L呈較為明顯的劑量依賴性，濃度超過(guò)100 nmol/L后OV-miR-107對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力基本保持穩(wěn)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100 nmol/L的濃度。細(xì)胞經(jīng)100 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染后，在不同時(shí)間點(diǎn)OV-miR-107組較KD-miR-107組和NC組對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性(P<0.05)，在72 h時(shí)抑制細(xì)胞增殖能力最明顯，見(jiàn)圖1。

A:不同濃度模擬物轉(zhuǎn)染48 h后各組OD值；B：miR-107過(guò)表達(dá)模擬物轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)OD值

圖1過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞增殖的影響

A：OV-miR-107組；B：KD-miR-107組；C：NC組；D：各組細(xì)胞周期占比情況

圖2過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.2過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后,OV-miR-107組、KD-miR-107組和NC組細(xì)胞G0G1所占比例分別為(68.880±0.175)%、(40.830±0.271)%和(46.160±0.182)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OV-miR-107組細(xì)胞S期及G2M期所占比均少于KD-miR-107組和NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-107與CCNE1 3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)

2.3過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞CCNE1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 生物信息學(xué)網(wǎng)站顯示CCNE1的3′-UTR區(qū)域246～253 bp是miR-107的結(jié)合位點(diǎn)，miR-107組海腎熒光素酶(RL)/螢火蟲(chóng)熒光素酶(FL)值小于NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。miR-107組CCNE1 mRNA和具體數(shù)值蛋白表達(dá)水平均較NC組低，見(jiàn)圖4。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞CCNE1 mRNA表達(dá) siRNA轉(zhuǎn)染36 h后，參照陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染靶向CCNE1的3條siRNA的CCNE1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。3條siRNA中，siRNA-2的siRNA沉默效果最好，其干擾效率達(dá)到(82.0±0.3)%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用siRNA-2，見(jiàn)圖5。

A：實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)CCNE1 mRNA表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)CCNE1蛋白表達(dá)

圖4過(guò)表達(dá)miR-107對(duì)細(xì)胞CCNE1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA后各組細(xì)胞CCNE1 mRNA表達(dá)

2.5CCEN1 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響 siRNA轉(zhuǎn)染后24 h，NC-siRNA組和siRNA-2組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制無(wú)明顯區(qū)別，但在48、72和96 h，siRNA-2組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制明顯強(qiáng)于NC-siRNA組(P<0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染36 h后，siRNA-2組細(xì)胞G0G1期所占比例明顯高于NC-siRNA組，而siRNA-2組細(xì)胞S期和G2M期細(xì)胞占比明顯低于NC-siRNA組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 CCEN1 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖和周期的影響

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的肺癌類型，但早期不易發(fā)現(xiàn)，患者確診時(shí)往往已經(jīng)處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，于是化療和分子靶向治療為其主要治療手段。對(duì)于常規(guī)化療無(wú)效或不能耐受聯(lián)合化療的晚期患者，化療的效果非常有限且療效較差，故這部分患者的5年生存率非常低[2]。根據(jù)分子生物學(xué)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)的靶向藥物治療非小細(xì)胞肺癌展現(xiàn)了一定的優(yōu)越性，如吉非替尼，但是以往報(bào)道稱吉非替尼只能抑制腫瘤的生長(zhǎng)而不會(huì)使腫瘤最終得到緩解。這是因?yàn)槟[瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，吉非替尼僅針對(duì)酪氨酸激酶?jìng)鲗?dǎo)通路，所起的治療作用也就有一定的局限性。很多學(xué)者對(duì)非小細(xì)胞肺癌中的差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行深入研究并探索其發(fā)生的機(jī)制，以期望能夠通過(guò)miRNAs 檢查篩選早期非小細(xì)胞肺癌和進(jìn)一步指導(dǎo)靶向藥物治療的研發(fā)。

筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-107在多種腫瘤中呈低表達(dá)，如胃癌、乳腺癌、肺癌等[9-12]，在一定程度上說(shuō)明miR-107的異常表達(dá)可能與這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)聯(lián)。XIA等[11]通過(guò)研究證實(shí)miR-107在30例非小細(xì)胞肺癌臨床標(biāo)本和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-107能靶向抑制BDNF表達(dá)，進(jìn)一步阻滯PI3K/AKT信號(hào)通路，最終抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力。ZHANG等[12]發(fā)現(xiàn)miR-107靶向抑制CDK8后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性增加。這些研究結(jié)果說(shuō)明miR-107在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和發(fā)展中扮演著抑癌基因的作用。為證實(shí)這一結(jié)論，筆者在A549細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和下調(diào)miR-107行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-107組細(xì)胞較下調(diào)miR-107組和陰性對(duì)照組明顯抑制了細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組較下調(diào)miR-107組和陰性對(duì)照組明顯阻滯了更多的細(xì)胞停留在G0G1期，細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-107在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用。

為了探討過(guò)表達(dá)miR-107能夠抑制細(xì)胞增殖和阻滯細(xì)胞周期的具體機(jī)制，筆者通過(guò)targetscan、miRanda和miRBase生物信息學(xué)網(wǎng)站對(duì)miR-107下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果交集發(fā)現(xiàn)CDK8和CCNE1序列上均有miR-107明確的結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)閙iRNA通過(guò)其序列5′-端的堿基可與多個(gè)基因的mRNA的靶點(diǎn)結(jié)合，即一個(gè)miRNA可與多個(gè)靶基因相結(jié)合。CDK8是細(xì)胞周期的調(diào)控因子，可激活Cyclin C，作用于G1S期，調(diào)控正常細(xì)胞周期，對(duì)于CDK8在肺癌組織中表達(dá)情況還未有大樣本臨床資料報(bào)道。CCNE1屬于細(xì)胞周期蛋白家族中的一員，細(xì)胞周期蛋白是調(diào)控細(xì)胞周期和變構(gòu)激活周期蛋白依賴性激酶所必需的蛋白，是調(diào)控細(xì)胞從G0G1期到S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中最基本和最廣泛的限速調(diào)節(jié)因子，CCNE1通過(guò)特異性結(jié)合和激活CDK2，正性調(diào)控使細(xì)胞從G0G1期進(jìn)入到S期。文獻(xiàn)報(bào)道在肺癌組織中CCNE1呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)[13]，同時(shí)在非小細(xì)胞肺癌中常常可以觀察到細(xì)胞組織紡錘體和中心體異常，這是因?yàn)榧?xì)胞中大量表達(dá)CCNE1引起的[14]。也就是說(shuō)CCNE1在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著促癌基因的角色。而且目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-107對(duì)CCNE1基因的調(diào)控機(jī)制。筆者構(gòu)建含有CCNE1基因3′-UTR片段的psiCHECK-2/CCNE1 3′-UTR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-107能直接結(jié)合質(zhì)粒的CCNE1的3′-UTR片段。鑒于雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)只能驗(yàn)證外源miRNA和外源CCNE1 3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)，筆者檢測(cè)了miR-107組和NC組CCNE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-107組細(xì)胞CCNE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較NC組明顯下調(diào)，說(shuō)明miR-107能直接結(jié)合CCNE1的3′-UTR區(qū)域，介導(dǎo)其mRNA的降解，并最終下調(diào)蛋白水平。

本文將CCNE1 siRNA轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR選擇siRNA-2序列進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-2的A549細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組，且其生長(zhǎng)抑制隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。流式周期顯示siRNA-2組較對(duì)照組阻滯更多細(xì)胞停留在G0G1期。細(xì)胞周期中G1S期轉(zhuǎn)換的交界點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，而CCNE1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞高表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限制增殖。

綜上所述，CCEN1是細(xì)胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子，miR-107靶向調(diào)節(jié)CCNE1影響A549細(xì)胞的增殖和調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)一步證實(shí)miR-107是介導(dǎo)肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要miRNA，并可能起著抑癌基因的作用。但miR-107對(duì)CCNE1具體調(diào)控機(jī)制，以及在CCNE1調(diào)控的G1/S交界點(diǎn)是否有特定因子的失調(diào)、缺失或過(guò)表達(dá)，都有待于進(jìn)一步探索。

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