吳丹 孟娜娜 韓楊 李玲玉 唐春銀

[摘要]目的 研究松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，為揭示松針油的抗胃癌作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 采用水蒸氣蒸餾法提取松針油。向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞中加入等體積不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；采用MTT法檢測(cè)松針油對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，將對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、不同濃度給藥組，加入不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h后每孔加MTT 20 μL，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值（OD值）。 結(jié)果 松針油給藥濃度越高，存活細(xì)胞越少，細(xì)胞發(fā)生體積變小、變圓、核固縮等形態(tài)學(xué)變化；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組的細(xì)胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL。 結(jié)論 松針油對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有抑制作用，且隨松針油濃度升高抑制作用明顯增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 松針油；胃癌；細(xì)胞增殖；MTT法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）03-0001-04

Influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901

WU Dan MENG Na'na HAN Yang LI Lingyu TANG Chunyin

Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901， and to provide a theoretical and experimental basis for revealing the mechanism of anticancer effects of essential oil extracted from pine needles against gastric cancer. Methods Essential oil from pine needles was collected by steam distillation. Equal volume of oil with different concentrations was added into human gastric cancer cell line SGC-7901 during its logarithmic phase， cell morphology was observed after 24 h of cell culture； cell proliferation was detected by MTT assay， cells in logarithmic phase were divided into negative control group and different concentrations groups， oil with different concentrations was added， after 24 hours of cell culture， 20 μL MTT was added into each hole， then after 4 hours of incubation in 37℃， 200 μL of 0.04 mol/L DMSO was added into each hole， optical density（OD） at 490 nm was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The higher the concentration of essential oil extracted from pine needles， the fewer the survival cells， morphological changes including the reduction of volume， turning round， karyopyknosis could be observed in the cells. The result of MTT indicated that the OD of 1：200， 1：300 and 1：400 groups decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the OD of 1：500 group also decreased with statistically significant difference（P<0.01）. The survival rate of cells in 1：200， 1：300， 1：400 and 1：500 decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the inhibitory concentration 50（IC50） was 1.9 mg/mL. Conclusion The essential oil extracted from pine needles can inhibit the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 in a concentration-dependent manner.

[Key words] Oil of pine needles； Gastric cancer； Cell proliferation； MTT assay

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤。全球每年大約有90多萬(wàn)新發(fā)的胃癌患者，其中70萬(wàn)以上死于胃癌及其相關(guān)疾病，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的惡性腫瘤，胃癌致死率僅次于肺癌，居全球癌癥死亡原因的第二位[1-3]。我國(guó)屬胃癌高發(fā)區(qū)，中國(guó)每年新發(fā)胃癌患者超過(guò)40萬(wàn)例，每年因胃癌及其相關(guān)疾病死亡的人數(shù)超過(guò)20萬(wàn)人，已成為我國(guó)位居首位的惡性腫瘤。近年來(lái)新發(fā)胃癌患者逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[4，5]。因此，胃癌已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病。目前手術(shù)、化療仍是治療胃癌的主要方法[6-8]，但中西醫(yī)結(jié)合治療胃癌將是一個(gè)必然的發(fā)展方向。中醫(yī)藥在治療胃癌的臨床工作中發(fā)揮著日益重要的作用，尤其在改善癌前病變[9-11]、減輕放化療毒副作用[12-15]、防止癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面已經(jīng)顯示出其廣闊的應(yīng)用前景[16，17]。

中藥松針（pine needle）為松科（pinaceae）松屬（pinus）植物的葉[18]，松針中含有豐富的化學(xué)成分，包括氨基酸、黃酮類(lèi)、木質(zhì)素、粗蛋白、葉綠素、維生素、粗纖維、可溶性多糖、礦質(zhì)元素等[19，20]。多項(xiàng)研究表明，松針提取物具有抗氧化[21，22]、抗菌[23]、降血脂[24]、降血糖[25]及抑制腫瘤[26]等藥理作用，有很高的藥用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。因此松針的深度研發(fā)具有重大意義。

研究表明：松針油可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2參與了松針油誘導(dǎo)的肝癌HepG 2細(xì)胞凋亡過(guò)程中端粒酶活性的調(diào)控[26]。而松針抑制胃癌細(xì)胞增殖的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究松針油對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響，為研究松針油抗胃癌的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞系

中藥松針購(gòu)自牡丹江市大藥房，人胃癌SGC-7901細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 松針油提取 采用水蒸氣蒸餾法，松針在實(shí)驗(yàn)室陰干后切成小于2 cm的小段，取松針100 g加到1000 mL的圓底燒瓶中，加入750 mL蒸餾水，置于水蒸氣蒸餾裝置中進(jìn)行提取，蒸餾4 h，取上層精油，用無(wú)水乙醚溶解，無(wú)水硫酸鈉脫水，得到淡黃色油狀液體。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用1640培養(yǎng)基稀釋已配好的松針油母液，依據(jù)松針油濃度分為1∶200組（4.40 mg/mL）、1∶300組（2.93 mg/mL）、1∶400組（2.20 mg/mL）、1∶500組（1.76 mg/mL）、1∶600組（1.47 mg/mL）；收集對(duì)數(shù)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞配成1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入等體積的不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 MTT法檢測(cè)松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。MTT法檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞用 0.25% 胰酶消化，離心去上清，用培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL。種96孔板，按每孔104個(gè)細(xì)胞種板，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度松針油給藥組[1∶200組（4.40 mg/mL）、1∶300組（2.93 mg/mL）、1∶400組（2.20 mg/mL）、1∶500組（1.76 mg/mL）、1∶600組（1.47 mg/mL）]；每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度的松針油，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，并增設(shè)陰性對(duì)照，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用吸管反復(fù)吹打使接近結(jié)晶顆粒溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度值（OD值）。

1.3觀察指標(biāo)

在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，包括細(xì)胞存活與死亡情況、存活細(xì)胞間空隙大小的改變、胞漿中變化、細(xì)胞形態(tài)與體積的改變。通過(guò)MTT法檢測(cè)松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較使用One Way Anova進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松針油的提取

提取得到淡黃色油狀液體，用1640培養(yǎng)基配制稀釋濃度為1∶100的松針油母液100 mL，質(zhì)量濃度為8.8 mg/mL，冷藏備用。

2.2 松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響

經(jīng)倒置顯微鏡觀察松針油作用24 h后，1∶200給藥組細(xì)胞基本死亡；其他濃度給藥組也有部分細(xì)胞死亡。給藥濃度越高，存活細(xì)胞越少。存活細(xì)胞間空隙變大，胞漿中出現(xiàn)顆粒樣和空泡樣變化，細(xì)胞變形伸展，體積變小、變圓，有的呈懸浮狀態(tài)，見(jiàn)封三圖1。

2.3 松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 松針油對(duì)不同組別細(xì)胞OD值的影響 與對(duì)照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

2.3.2 松針油對(duì)不同組別細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組的細(xì)胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表2。

2.3.3 松針油對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的半數(shù)抑制濃度（IC50） 松針油對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL，見(jiàn)封三圖2。松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，隨著給藥濃度的升高，對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)。

3 討論

目前癌癥死亡率僅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的趨勢(shì)，胃癌占全球癌癥死亡原因的第二位，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高的三高特點(diǎn)。胃癌的早期診斷率很低，很多患者在就診時(shí)已處于胃癌中后期，即使進(jìn)行手術(shù)切除患處，仍有一半以上的患者會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此，胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療的主要難點(diǎn)。當(dāng)前胃癌的常用治療手段包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療及新近發(fā)展起來(lái)的分子靶向藥物治療等。然而，外科手術(shù)、放療、化療等胃癌治療手段在治療的同時(shí)帶來(lái)了如肝腎損傷、骨髓抑制等一系列醫(yī)源性疾病，胃癌的臨床治療面臨著巨大挑戰(zhàn)。因此，積極探索與開(kāi)發(fā)胃癌治療新途徑，對(duì)胃癌的治療及改善胃癌患者的生存質(zhì)量、延長(zhǎng)胃癌患者的生存期具有重要的臨床意義。

目前的化學(xué)合成藥物雖然抗腫瘤作用確切，療效顯著，但有不良反應(yīng)大、長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤治療領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力引起人們廣泛的關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為胃癌是由于肝胃不和，氣郁血逆，脾運(yùn)失常，濕痰凝聚，瘀熱內(nèi)蓄成毒，結(jié)于胃腑而成癌腫。研究表明：中藥扶正祛邪，健脾和胃，補(bǔ)氣養(yǎng)血，能夠有效保護(hù)各器官組織的正常功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，能明顯減輕放療、化療的副反應(yīng)，并且能顯著增強(qiáng)腫瘤對(duì)放、化療的敏感性；同時(shí)，中藥的扶正抗癌作用能夠有效抑制癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、分化、轉(zhuǎn)移，緩解癥狀，減輕痛苦，延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者的生存質(zhì)量。中醫(yī)藥具有獨(dú)特的理論體系和用藥方式，與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療相比，具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、毒副作用小等特點(diǎn)，在腫瘤治療方面具有西藥所不具備的優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的發(fā)展前景。

已有研究表明：松針油可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2參與了松針油誘導(dǎo)的肝癌HepG 2細(xì)胞凋亡過(guò)程中端粒酶活性的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)研究松針油對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：松針油給藥后胃癌細(xì)胞產(chǎn)生胞間間隙變大、體積變小、變圓、核固縮等形態(tài)學(xué)變化；另外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組的細(xì)胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細(xì)胞存活率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL。松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有抑制作用，且隨松針油濃度升高，抑制作用明顯增強(qiáng)。

綜上所述，松針油對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，這為進(jìn)一步研究松針油抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為研究中藥及其提取物抗胃癌的應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用松針油抑制胃癌細(xì)胞增殖可能是胃癌治療的一種新策略，為中藥抗腫瘤研究開(kāi)辟了新的途徑。

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（收稿日期：2017-11-21）