江成英，王 松，李 琰，徐婷婷，郭宏文，張文學(xué)，韓國棟，姜未公

（1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米黃粉是濕法生產(chǎn)玉米淀粉在麩質(zhì)分離過程中的副產(chǎn)物，其蛋白含量為31%～60%，有的甚至達到70%，可以作為蛋白質(zhì)添加劑添加到飼料中，能有效提高飼料的蛋白質(zhì)含量[1-3]。但由于玉米黃粉中的蛋白主要為醇溶蛋白，水溶性差，動物很難將其有效利用，從而造成了蛋白質(zhì)原料的浪費[4-6]。為了提高玉米黃粉蛋白的利用率，可采用微生物發(fā)酵法改善玉米黃粉中蛋白的溶解性[7-9]。

復(fù)合菌種發(fā)酵指的是包括兩種或兩種以上多種菌株共生發(fā)酵的過程。大多數(shù)試驗表明，復(fù)合菌發(fā)酵中的微生物生長狀況優(yōu)于單菌發(fā)酵體系，可以利用復(fù)合菌協(xié)同互補作用共同提高發(fā)酵效果[10-11]。張建華[12]將白地霉（Geotrichum candidum）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、綠色木霉（Trichoderma viride）以1∶1∶1的比例混合，按5%的接種量接入酒糟于28℃條件下發(fā)酵3 d，與單菌種發(fā)酵比較，產(chǎn)物中的單細胞蛋白含量增加了6.16%；王曉凡等[13]以菜籽粕為原料，選擇植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、米曲霉（Aspergillus oryzae）進行單菌和混菌的固態(tài)發(fā)酵，研究其對菜籽粕硫苷和粗蛋白含量的影響，結(jié)果表明，多菌種復(fù)合發(fā)酵效果優(yōu)于單菌發(fā)酵；潘鋒等[14]以稻草為原料，利用酵母菌和真菌混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，結(jié)果表明，與單菌發(fā)酵相比，經(jīng)產(chǎn)纖維素酶菌與酵母菌混合發(fā)酵可大幅提高產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量。雖然復(fù)合菌種發(fā)酵的優(yōu)勢已得到了充分肯定，但對混合菌系中菌間相互關(guān)系和作用機制研究尚不夠深入。因此，目前對于具有協(xié)同作用關(guān)系的菌株篩選和組合還是一個重要的研究方向。

本研究選用農(nóng)業(yè)部許可用于發(fā)酵飼料的產(chǎn)蛋白酶較高的6種菌株：凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱乳酸桿菌（Lactobacillus thermophilus）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheni formis），以各菌種對玉米黃粉的利用能力、共生狀況及復(fù)合發(fā)酵能力為評價指標(biāo)，篩選出固態(tài)發(fā)酵玉米黃粉飼料的適宜復(fù)合菌種。以期提高玉米黃粉蛋白的可溶性，相應(yīng)地提高玉米黃粉作為飼料的動物消化利用率，促進玉米蛋白質(zhì)資源的有效利用，對于有效緩解由于蛋白質(zhì)資源來源不足制約畜牧業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和原料

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱乳酸桿菌（Lactobacillus thermophilus）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）均為齊齊哈爾大學(xué)生物工程實驗室保藏。

玉米黃粉、麩皮：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

無水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、氫氧化鈉、氯化鈉、葡萄糖、濃鹽酸、碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、液體溴、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、濃硫酸、三氯乙酸、硫酸鎂、檸檬酸氫二銨等（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、氯化鈉1%、酵母粉0.5%、pH 7.0～7.4，121℃蒸汽滅菌20 min，用于培養(yǎng)納豆芽孢桿菌。

MRS乳酸細菌培養(yǎng)基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、葡萄糖2%、吐溫-80 0.1%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳0.02%，pH 6.2～6.6，121℃蒸汽滅菌20 min，用于培養(yǎng)嗜熱乳酸桿菌和嗜酸乳酸桿菌。

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：蛋白胨1%、牛肉粉0.3%、氯化鈉0.5%、pH 7.2～7.4，121℃蒸汽滅菌20 min，用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、pH自然，121℃蒸汽滅菌20 min，用于培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌。

玉米黃粉瓊脂培養(yǎng)基：玉米黃粉20%，瓊脂2%，pH 6.5～7.5，121℃蒸汽滅菌20 min，用于平板點種和平板點種刺激圈試驗，測定微生物對玉米黃粉的利用情況。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米黃粉70%，麩皮30%，料水比1∶1.2（g∶mL），瓊脂2%，121 ℃蒸汽滅菌20 min，用于測定微生物對玉米黃粉的發(fā)酵能力。

1.2 儀器與設(shè)備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；ZHJ-C2109C超凈工作臺：上海智城分析儀器有限公司；BS224S型電子天平：北京塞多利斯儀器廠；TV1901紫外可見分光光度計：北京譜析通用儀器有限公司；PHS-25數(shù)顯PH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

將配制好的培養(yǎng)基分別于121℃蒸汽滅菌20 min后，冷卻至室溫，分別將6種試驗菌種接入到其對應(yīng)的最適固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)30℃條件下培養(yǎng)48 h，備用。

1.3.2 液體菌種擴大培養(yǎng)

挑取一環(huán)活化好的菌種接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

1.3.3 平板點種

為確定所選6種菌種是否能利用玉米黃粉的營養(yǎng)生長，將液體擴大培養(yǎng)的菌種點種在玉米黃粉瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌圈的大小和生長趨勢，判斷其利用玉米黃粉的能力[15]。

1.3.4 固體發(fā)酵試驗

將單菌種或混合菌種接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，置于30℃條件下發(fā)酵84 h或120 h，每隔12 h或24 h測定其蛋白酶活力或可溶性蛋白含量。

1.3.5 平板點種刺激圈試驗

將篩選出來的指示菌株涂布在玉米黃粉固體培養(yǎng)基中，分別將其他幾種待測菌種以每種2 μL的量點種在培養(yǎng)基中央，于30℃條件下培養(yǎng)約48 h觀察其生長狀態(tài)和刺激圈情況，篩選出雙菌組合[16]。

1.3.6 分析檢測

可溶性蛋白含量的測定采用福林酚法[17]；蛋白酶活力的測定采用福林酚法[18]，在pH 7.0、40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位；總蛋白測定采用凱氏定氮法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 待用菌株的初篩

將凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、嗜酸乳酸桿菌（L.acidophilus）、嗜熱乳酸桿菌（L.thermophilus）、納豆芽孢桿菌（B.natto）以及地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）這6種菌株制成的菌懸液，以每種2 μL的菌量分別點種在玉米黃粉固體平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)48 h，觀察每種菌的生長狀況，初步篩選出能用于發(fā)酵玉米黃粉的菌種，結(jié)果見圖1。

圖1 平板點種法培養(yǎng)各菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strains cultured by dot-inoculation

由圖1可知，在玉米黃粉固體培養(yǎng)基上嗜酸乳酸桿菌基本沒有生長，而其他菌均長勢良好，說明嗜酸乳酸桿菌不能利用玉米黃粉的營養(yǎng)生長，而凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳酸桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌都可很好地利用玉米黃粉。因此，初步篩選出凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱乳酸桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為發(fā)酵玉米黃粉飼料的待用菌株。

2.2 指示菌的篩選

將篩選出的待用菌株凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱乳酸桿菌、納豆芽孢桿菌分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中進行擴培，以5%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。從培養(yǎng)24 h后開始每12 h取樣測定蛋白酶活力，篩選出用于發(fā)酵玉米黃粉的指示菌種，結(jié)果見表1。

表1 待選菌株在發(fā)酵過程中的蛋白酶活力Table 1 Protease activities of screening strains during the fermentation process

由表1可知，各種菌在發(fā)酵玉米黃粉過程中，蛋白酶活力均隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增強，當(dāng)發(fā)酵72 h時蛋白酶活力均達到最大；繼續(xù)延長發(fā)酵時間，各種菌的蛋白酶活力均出現(xiàn)下降。其原因可能是由于發(fā)酵前期，發(fā)酵物料中營養(yǎng)豐富，使菌種快速生長并大量產(chǎn)酶；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵物料中營養(yǎng)大量消耗，導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶量降低，這與朱平軍等[19-20]研究結(jié)果基本一致。各種菌種的產(chǎn)酶趨勢雖然是一致的，但產(chǎn)酶能力差異較大，其中枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力最強，在72 h時達到最大，為（344.16±0.59）U/g。因此，選擇枯草芽孢桿菌作為指示菌進行后續(xù)試驗。

2.3 共生菌株的篩選

將初篩得到的5種菌株分別接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中30℃活化培養(yǎng)48 h。以篩選出的枯草芽孢桿菌作為指示菌與其他4種菌進行平板點種刺激圈試驗，篩選出能與其協(xié)同共生的菌株，結(jié)果如圖2所示。

將每種待選菌株點種在涂布枯草芽孢桿菌的玉米黃粉培養(yǎng)基平板的正中央，通過觀察點種菌及周圍指示菌的生長狀況，判斷兩種菌種生長關(guān)系。若生長趨勢較弱，則相互抑制；若生長趨勢較強，則相互促進。由圖2可知，點種納豆芽孢桿菌的平板上點種菌周圍的指示菌基本沒有生長，而點種嗜熱乳酸桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的平板上點種菌及周圍指示菌均能生長，其中點種凝結(jié)芽孢桿菌的平板上點種菌及周圍指示菌均長勢旺盛。因此，選枯草芽孢桿菌與凝結(jié)芽孢桿菌作為下一步試驗的共生菌株。

圖2 點種刺激圈法培養(yǎng)各菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of each strain by dot-inoculating stimulus circle method

2.4 發(fā)酵用復(fù)合菌種的篩選

以篩選出來的共生菌株枯草芽孢桿菌與凝結(jié)芽孢桿菌的混合菌作為基礎(chǔ)菌，分別與嗜熱乳酸桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1的比例混合，以5%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取樣測定可溶性蛋白含量，以確定發(fā)酵玉米黃粉的復(fù)合菌種，結(jié)果見表2。

表2 不同復(fù)合菌發(fā)酵過程中的可溶性蛋白含量檢測結(jié)果Table 2 Detection results of soluble protein contents during the fermentation process

由表2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，兩種復(fù)合菌種發(fā)酵玉米黃粉的可溶性蛋白含量均不斷提高，但利用復(fù)合菌種枯草芽孢桿菌+凝結(jié)芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌發(fā)酵的玉米黃粉的可溶性蛋白含量提高幅度更大，當(dāng)發(fā)酵時間為120 h時，可溶性蛋白含量達到14.26%。因此，通過篩選確定發(fā)酵玉米黃粉的復(fù)合菌種為枯草芽孢桿菌+凝結(jié)芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌。

2.5 發(fā)酵驗證試驗

將活化好的枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以1∶1∶1的比例混合，按5%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中于30℃條件下發(fā)酵120 h，進行三組平行。測定發(fā)酵前及發(fā)酵結(jié)束后其干基中可溶性蛋白質(zhì)及粗蛋白質(zhì)含量，以驗證所篩選菌種發(fā)酵玉米黃粉生產(chǎn)蛋白飼料的效果，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵前后飼料中可溶性蛋白及粗蛋白含量比較Table 3 Comparison of soluble protein and crude protein contents in the feed before and after fermentation

由表3可知，發(fā)酵后飼料中粗蛋白含量僅有少量的提高，而可溶性蛋白的含量提高幅度較大，由發(fā)酵前的3.78%提高至14.26%。根據(jù)物質(zhì)守恒定律，在發(fā)酵過程中，總氮含量基本不變，出現(xiàn)的少許增加可能是發(fā)酵濃縮效應(yīng)引起的，這與韓佳東等[21-22]的研究結(jié)果相似；而發(fā)酵飼料中可溶性蛋白含量的增加是由于微生物生長繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶將玉米黃粉中的水不溶性蛋白質(zhì)分解成溶于水的小肽等物質(zhì)引起的，魏炳棟等[23]在此理論指導(dǎo)下以多肽得率為指標(biāo)研究了發(fā)酵玉米蛋白粉的條件。

3 結(jié)論

本試驗通過平板點種、點種刺激圈和多菌種混合固態(tài)發(fā)酵3種主要方法篩選出能發(fā)酵玉米黃粉生產(chǎn)飼料的優(yōu)良復(fù)合菌種。試驗分析結(jié)果表明，以玉米黃粉為主要原料，采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白飼料時，選用枯草芽孢桿菌+凝結(jié)芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌作為復(fù)合菌種效果較好。將枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1的比例混合，按5%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃條件下發(fā)酵120 h時其可溶性蛋白含量可高達14.26%，較發(fā)酵之初提高了10.52%。因此，利用該復(fù)合菌種發(fā)酵玉米黃粉生產(chǎn)飼料，可大大提高玉米黃粉的動物消化利用率，促進玉米蛋白質(zhì)資源的有效利用。

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