馬貴范，劉振華，田永勝，王 波，孫宗哲，李祥孔,5，宋莉妮,6，李 洪,6

(1.威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東 榮成 264300; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071; 3.國家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島 266000; 4.蓬萊宗哲養(yǎng)殖有限公司,山東 蓬萊 265617; 5.大連海洋大學(xué),遼寧 大連 116023; 6.上海海洋大學(xué),上海 201306)

星斑川鰈(Platichthysstellatus)和石鰈(Kareiusbicoloratus)同為鰈形目、鰈科，分屬于川鰈屬與石鰈屬。星斑川鰈主要分布在北太平洋的亞洲和美洲沿岸海域[1-3]，于2000年突破人工育苗技術(shù)，因其具有食性雜、耐低氧、生長快、成活率高、適合集約化養(yǎng)殖等優(yōu)勢而頗受市場關(guān)注[4-10]。石鰈主要分布在我國黃渤海海域和日本、朝鮮等海域，人工繁殖技術(shù)于1991年取得成功，該魚具有耐低溫、抗逆性強(qiáng)、餌料利用率高和養(yǎng)殖成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來工廠化和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一[11-12]。但近幾年種質(zhì)退化和養(yǎng)殖環(huán)境惡化而引起病害頻發(fā)、死亡加劇，導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下滑[13]，因此養(yǎng)殖品種改良已成當(dāng)務(wù)之急。

應(yīng)用雜交理論與技術(shù)對魚類進(jìn)行良種選育已有100多年的歷史[14]，雜交不僅能豐富物種的遺傳結(jié)構(gòu)，還能迅速和顯著地提高后代雜種優(yōu)勢，通過親本基因的分離和重組可篩選出具有雙親優(yōu)良性狀的雜交后代[15]，所以雜交成為動(dòng)物育種的主要手段之一。在鲆鰈魚類中，遠(yuǎn)緣雜交已見于歐洲鰈(Pleuronectesplatessa)×大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)[16]，褐牙鲆(Paralichthysolivaceas)×圓斑星鰈(Veraspervariegates)[17]，浦氏光鰈(Liopesettaputnami)×美洲擬鰈(Pseudopleuronectesamericanus)[18]，圓斑星鰈×石鰈[19]等。Yamashita等[20]報(bào)道了星斑川鰈與石鰈雜交子代的變態(tài)發(fā)育，但尚未見對二者雜交子代胚胎發(fā)育生物學(xué)方面的研究報(bào)道。因此，筆者以星斑川鰈為母本，石鰈為父本，進(jìn)行了二者的屬間遠(yuǎn)緣雜交，并對雜種的胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了研究，以期豐富二者雜種后代的基礎(chǔ)生物學(xué)，為雜種優(yōu)勢的獲得提供科學(xué)依據(jù)；另一方面充分利用雜種優(yōu)勢以期調(diào)整鲆鰈魚類養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)，豐富養(yǎng)殖品種。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年4月在蓬萊宗哲水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行星斑川鰈和石鰈雜交試驗(yàn)，試驗(yàn)所用親魚為人工養(yǎng)殖培育，星斑川鰈(♀)質(zhì)量1500 g，石鰈(♂)質(zhì)量500 g，經(jīng)過溫度、光照以及營養(yǎng)調(diào)控，親魚經(jīng)注射人絨毛膜促性腺激素和促黃體激素釋放激素催產(chǎn)24～48 h后，通過腹部擠壓方法獲得成熟的卵子和精液，進(jìn)行干法受精。具體過程為：通過目測觀察，挑選腹部隆起較高的雌魚，用抄網(wǎng)輕輕撈起，手輕壓腹部感到柔軟則性腺發(fā)育成熟。挑選出成熟親魚后，用紙巾將生殖孔附近的海水擦拭干凈，開始輕壓腹部將卵擠到燒杯中，同時(shí)挑選成熟較好的雄魚，采集精液，加入星斑川鰈卵中，將精液與卵混合均勻，加入2倍于卵的過濾海水激活受精。受精完成后10 min加入適量海水，待受精卵充分上浮，使用200目篩絹漂洗、過濾收集上浮受精卵，均勻分布在控溫網(wǎng)箱中，控制孵化水溫為13～14 ℃，同時(shí)充氣增氧。

1.2 胚胎發(fā)育觀察方法

利用DCM130-2.0顯微電子成像系統(tǒng)觀察受精卵胚胎發(fā)育情況并拍照。詳細(xì)記錄各時(shí)期發(fā)育特點(diǎn)及發(fā)育時(shí)間，并統(tǒng)計(jì)受精與孵化數(shù)據(jù)。借助XTZ-D體視顯微鏡進(jìn)行輔助拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法和胚胎發(fā)育畸形觀察

人工受精2.5 h后，從受精卵中隨機(jī)抽取30～50粒，以是否發(fā)育到卵裂期作為受精的標(biāo)志，統(tǒng)計(jì)卵的總數(shù)和受精卵的數(shù)量，計(jì)算受精率。從受精卵中隨機(jī)抽取約200粒放入1 L燒杯中，在恒溫培養(yǎng)箱中13～14 ℃培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)孵化率。胚胎發(fā)育的過程中，分別在卵裂期、原腸期、胚體出現(xiàn)期、肌節(jié)期、尾芽期、出膜期隨機(jī)抽取30～50粒胚胎進(jìn)行鏡檢，觀察和記錄胚胎發(fā)育的情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)育畸形的胚胎數(shù)量，計(jì)算胚胎發(fā)育的畸形率。

1.4 圖片制作和數(shù)據(jù)處理

利用Photoshop 7.0制作胚胎發(fā)育圖片，采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 受精卵與受精率

星斑川鰈與石鰈雜交后代的受精卵為圓球形，呈淡黃色，略透明，卵膜較薄，膜間隙約為12～14 μm，半浮性，無油球，受精卵的平均卵徑為1.02 mm。受精10 min后加入一定量的海水，會(huì)發(fā)現(xiàn)正常受精或發(fā)育良好的受精卵上浮，過熟或未受精的受精卵則下沉。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交的受精率為(15.6±0.02)%。

表1 星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交的受精率、孵化率及畸形率

2.2 胚胎發(fā)育

2.2.1 卵裂期

受精后2.5 h，受精卵(圖1a)開始第一次卵裂(經(jīng)裂)。卵裂的方式為盤狀卵裂，即卵子的原生質(zhì)集中在動(dòng)物極的一小部分區(qū)域，并稍微隆起形成帽狀的胚盤，卵裂只在胚盤中進(jìn)行，卵黃不參與卵裂。首先胚盤中部凹陷形成分裂溝并加深延長，形成兩個(gè)大小相等的分裂球，進(jìn)入 2 細(xì)胞期(圖1b)。4 h后受精卵進(jìn)行第二次卵裂，仍為經(jīng)裂，出現(xiàn)與第一次卵裂方向相垂直的分裂溝，形成 4 個(gè)大小近似相等的細(xì)胞，細(xì)胞排列緊密，進(jìn)入 4 細(xì)胞期(圖1c)。第二次卵裂結(jié)束0.5 h后發(fā)生第三次卵裂，分裂溝方向與第一次卵裂相平行，每個(gè)細(xì)胞一分為二分裂為8個(gè)細(xì)胞(圖1d)。第四次卵裂出現(xiàn)在受精5 h，左右兩列細(xì)胞繼續(xù)分裂，每個(gè)細(xì)胞橫裂為 2 個(gè)細(xì)胞，每列 8 個(gè)共 16 個(gè)細(xì)胞，胚體進(jìn)入 16細(xì)胞期(圖1e)。2 h后，發(fā)生第五次卵裂，分裂溝消失，分裂球更小，進(jìn)入32細(xì)胞期(圖1f)。第六次卵裂即32細(xì)胞變?yōu)?4細(xì)胞(圖1g)時(shí)，開始第一次緯裂，細(xì)胞分為兩層，自此細(xì)胞經(jīng)裂、緯裂交替進(jìn)行，卵裂不同步，分裂球大小、形狀不規(guī)則，進(jìn)入多細(xì)胞期，直至受精后12 h，進(jìn)入桑葚期(圖1i)。

2.2.2 囊胚期

隨著細(xì)胞繼續(xù)分裂，囊胚腔形成，分裂球增多胚盤隆起并逐漸達(dá)到最高，形成了類似帽狀的高囊胚(圖1j)，此期與桑葚期相比細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積變小，排列不規(guī)則，界限不清楚。隨后隆起的高囊胚層細(xì)胞逐漸沿著卵黃囊表面向四周下包，囊胚層的高度不斷降低，囊胚邊緣細(xì)胞增多，進(jìn)入低囊胚期(圖1k)。

2.2.3 原腸期

在受精后26 h囊胚層的細(xì)胞開始向植物極下包，雙胚層形成，并在此基礎(chǔ)上組織器官開始分化，當(dāng)囊胚下包到卵黃的1/3位置處，囊胚層外周的邊緣有大量細(xì)胞積聚，形成胚環(huán)，即進(jìn)入原腸早期(圖1l)；隨后囊胚繼續(xù)下包，下包至卵黃1/2位置時(shí)，進(jìn)入原腸中期(圖1m)；胚層下包到卵黃3/4處，胚環(huán)明顯縮小，植物極方向僅漏出小部分卵黃，胚孔形成，進(jìn)入原腸晚期(圖1n)。

表2 星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交胚胎發(fā)育時(shí)序水溫(13 ℃)

2.2.4 器官形成期

受精后48 h，雜交的胚孔關(guān)閉，出現(xiàn)胚體，胚體匍匐在卵黃上，圍繞卵黃1/3(圖1o)；7 h后明顯可見頭部，并在其背部出現(xiàn)脊索(圖1p)；受精后58 h胚體上可見均等的凹陷，為肌節(jié)出現(xiàn)期(圖1q)，胚體中肌節(jié)4～5對，脊椎形成，同時(shí)在胚體尾部出現(xiàn)末球；隨著頭部器官的進(jìn)一步分化，受精后70 h視胞形成，并出現(xiàn)雛形心室(圖1r)；79 h心胞形成，聽囊內(nèi)出現(xiàn)雛形耳石(圖1s)；受精83 h，胚體尾部向后發(fā)育進(jìn)一步延長形成尾芽，此時(shí)末球消失，脊椎明顯，肌節(jié)數(shù)增至11～14對，胚體繞卵黃約3/4(圖1t)；受精后87 h，心臟開始有規(guī)律地搏動(dòng)，血管清晰，貫穿魚體前后部，血管血液循環(huán)明顯(圖1u)，4 h后魚體開始抽搐式運(yùn)動(dòng)，尾部進(jìn)一步發(fā)育延長，魚體繞卵黃超過一周，聽囊中的耳石明顯可見，胚體不斷抽動(dòng)和尾部擺動(dòng)，使其在卵膜內(nèi)旋轉(zhuǎn)并抽搐式運(yùn)動(dòng)(圖1v)。

2.2.5 破膜期及孵化率

胚胎發(fā)育進(jìn)入孵化期后，卵膜薄而透明，隨著胚體擺動(dòng)與扭動(dòng)頻率和幅度不斷加大，胚胎與卵膜分離，胚體的劇烈運(yùn)動(dòng)對受精卵的內(nèi)壁產(chǎn)生足夠大的壓力，不久即破膜而出(圖1w)。破膜時(shí)一部分胚體頭部先脫離卵黃，但尾部仍繼續(xù)擺動(dòng)直至完全脫離卵黃，另外一部分是尾部先脫離卵黃，頭部最后脫離出來。雜交后代的孵化率為(42.1±0.23)%。

2.3 雜交胚胎畸形觀察

在星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交后代胚胎發(fā)育期間，觀察了畸形胚胎發(fā)育情況，畸形率為(57.1±0.03)%?；闻咛グl(fā)生的胚胎時(shí)期及畸形胚胎的形狀、特征見表3。

表3 星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交胚胎發(fā)育畸形現(xiàn)象

3 討 論

3.1 鲆鰈類雜交受精率與孵化率比較

有學(xué)者認(rèn)為，鲆鰈類進(jìn)化較晚，在科屬間進(jìn)行雜交從而獲得具有優(yōu)良品質(zhì)的雜交后代具有較大的可行性[14]。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果，除星斑川鰈(♂)×大菱鲆(Scophthalmusmaximus,♀)雜交不能獲得正常發(fā)育的個(gè)體外[21]，星斑川鰈(♀)×圓斑星鰈(♂)雜交后可發(fā)育至卵裂期的為11%[22]；星斑川鰈(♀)×條斑星鰈(V.moseri,♂)雜交后代的受精率可達(dá)65.7%[22]；星斑川鰈(♀)×鈍吻黃蓋蝶(P.yokohamae,♂)的受精率和孵化率較高[14]；說明以星斑川鰈為親本可以與多種鲆鰈魚類雜交產(chǎn)生后代。本研究中，雖然星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)的受精率(能發(fā)育至卵裂期)僅為15.6%，但孵化率相對較高，可達(dá)到42.1%，說明星斑川鰈與×石鰈進(jìn)行雜交育種具有較高的潛力，Yamashita等[20]的研究也表明星斑川鰈與石鰈雜交可以培育出新品種，并且雜交后代的生長速度介于兩親本生長速度之間。

圖1 星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)的雜交胚胎正常發(fā)育a：受精卵；b：2細(xì)胞期；c：4細(xì)胞期；d：8細(xì)胞期；e：16細(xì)胞期；f：32細(xì)胞期；g：64細(xì)胞期；h：多細(xì)胞期；i：桑椹期；j：高囊胚期；k：低囊胚期；l：原腸早期；m：原腸中期；n：原腸后期；o：胚體出現(xiàn)期；p：脊索出現(xiàn)期；q：肌節(jié)出現(xiàn)期；r：視胞形成期；s：心胞形成期；t：尾芽形成期；u：心臟開始跳動(dòng)；v：抽搐期；w：破膜期.

圖2 星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)的雜交的畸形胚胎a：卵裂不正常；b：胚孔關(guān)閉受阻；c：發(fā)育緩慢；d：胚體出現(xiàn)斷裂；e：尾部伸展不正常；f：尾部發(fā)育不正常；g：出膜后發(fā)育不正常.

3.2 星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)的孵化時(shí)間

3.3 星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)的胚胎發(fā)育特點(diǎn)

星斑川鰈和石鰈的成熟卵子均為半浮性卵，無油球，卵膜光滑透明而薄，受精卵發(fā)育時(shí)間長，星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)胚胎發(fā)育時(shí)序和發(fā)育特征與其他鰈科魚類雜交組合基本相似，大致分為卵裂、囊胚、原腸胚、器官形成、脫膜孵化5個(gè)時(shí)期[15,22]。因?yàn)轸~類胚胎發(fā)育具有種的特異性[26]，導(dǎo)致不同魚類的胚胎發(fā)育各不相同。與親本比較，雜種的胚胎發(fā)育在每個(gè)階段內(nèi)的詳細(xì)發(fā)育分期上有所不同，主要有以下特點(diǎn)：(1)雜交后代囊胚階段持續(xù)時(shí)間較長(8 h)，星斑川鰈自交高囊胚期和低囊胚期僅持續(xù)2 h；(2)雜交后代原腸胚階段持續(xù)時(shí)間較短(16 h)，星斑川鰈自交原腸胚開始到胚體器官分化需要24 h；(3)雜交后代、星斑川鰈自交胚胎[22]及石鰈自交胚胎[26]均在心跳發(fā)生以后開始出現(xiàn)胚體扭動(dòng)，但雜交后代心臟搏動(dòng)至破膜期發(fā)育時(shí)間較短，僅需要11 h。

3.4 胚胎畸形的發(fā)生現(xiàn)象

考慮到本雜交組合為屬間雜交，與一般自交不同的是，除正常發(fā)育胚胎外，還出現(xiàn)因雜交兩親本遺傳特性不同，如繁殖習(xí)性和生態(tài)習(xí)性的差異，雜交后胚胎停止發(fā)育和畸形率較高(57.1%)。這些胚胎在細(xì)胞分裂期、原腸期、尾芽形成期、破膜期等出現(xiàn)異常，如細(xì)胞分裂不正常、分裂細(xì)胞大小不一，細(xì)胞排列不規(guī)則，胚孔封閉受阻，胚體出現(xiàn)斷裂，胚胎發(fā)育遲緩甚至停止，尾部發(fā)育不正常導(dǎo)致不能歪曲，脊索向后伸展不正常，破膜受阻，不能孵化成初孵仔魚等。本研究較詳細(xì)觀察了這些現(xiàn)象，而在其他屬間雜交組合中未見報(bào)道。

4 結(jié) 論

在脊椎動(dòng)物中，魚類是較易發(fā)生雜交的動(dòng)物之一，前人的研究中已產(chǎn)生了不少具有生產(chǎn)或育種價(jià)值的雜交種，雜交已成為魚類育種的重要手段。海水魚類的繁殖中較少使用雜交手段，海水鲆鰈魚類中目前已進(jìn)行了海鰈(♀)×河鰈(♂)(Pleuronectesflesus)、歐洲黃蓋鰈(♀)(Limandalimanda)×川鰈(Platichthysflesus)(♂)、海鰈(♀)×大菱鲆(♂)、河鰈(♀)×大菱鲆(♂)、圓斑星鰈(♀)×石鰈(♂)、漠斑牙鲆(♀)(Paralichthyslethostigma)×白點(diǎn)牙鲆(♂)(P.albiguta)之間的雜交等[19]。星斑川鰈和石鰈同屬于鰈形目、鰈科，從分類學(xué)的角度二者間的雜交屬于遠(yuǎn)緣雜交，從地理位置看二者雜交屬于地理遠(yuǎn)緣雜交。分類地位越相近的物種雜交，理論上成功的可能性就越大；而地理上的遠(yuǎn)緣雜交，不僅后代變異幅度大、類多而且常常出現(xiàn)一些珍貴的超親性狀和超親類型，而且其后代性狀也較穩(wěn)定[28]，以上構(gòu)成了選擇星斑川鰈、石鰈作為親本的理論依據(jù)。在星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)雜交試驗(yàn)中，雜交受精率為15.6%，雜交胚胎中有一定量的畸形胚胎(57.1%)，能夠正常發(fā)育胚胎的孵化率可達(dá)到41.2%，說明星斑川鰈(♀)與石鰈(♂)的雜交是可行的，兩親本相容性較好。但目前對星斑川鰈(♀)×石鰈(♂)雜交后代的研究有限，對雜交子一代各方面特性的了解還不夠充分，有關(guān)雜交子一代在生長、抗逆性和抗病等方面的生物學(xué)特性，以及雜交后代與親本在表型性狀、遺傳性狀等方面的區(qū)別，還有待進(jìn)一步的研究。

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