于佐安，李大成，王笑月，張 明，林杉杉，付成東，劉項峰，周遵春

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，應用海洋生物技術開放實驗室，水產(chǎn)分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023)

2007年至今，長?？h筏養(yǎng)蝦夷扇貝(Pationopectenyessoensis)連續(xù)多年大規(guī)模死亡，尤其在2齡貝養(yǎng)成期的6—9月死亡率最高，導致當前該海區(qū)筏養(yǎng)蝦夷扇貝產(chǎn)業(yè)以一齡貝養(yǎng)殖為主。與此相似，20世紀90年代，櫛孔扇貝(chlamysfarreri)爆發(fā)大規(guī)模死亡[1],國內(nèi)學者從病害、養(yǎng)殖密度、海區(qū)環(huán)境等角度對其死亡原因開展研究，張福綏等[2]認為在夏季高溫期，海區(qū)餌料不足，消耗增大，養(yǎng)殖水體污染和病原體滋生等是直接原因；而宋微波等[3-4]認為一種球形病毒是導致櫛孔扇貝大規(guī)模死亡的直接原因。另有研究表明，高溫是引發(fā)養(yǎng)殖貝類大規(guī)模死亡的主要環(huán)境脅迫因素，高溫可以對生物機體產(chǎn)生熱脅迫，進而對生物產(chǎn)生多方面影響[5-8]。而夏季海區(qū)持續(xù)的高溫可導致貝類的血細胞濃度、吸附能力以及吞噬活性顯著降低，影響存活細胞以及死亡細胞的能力，誘發(fā)扇貝疾病生長死亡[9-13]。滕煒鳴等[14]從蝦夷扇貝閉殼肌膿胞中分離出一株查氏弧菌(Vibriochagasii)，經(jīng)鑒定確認，查氏弧菌是導致蝦夷扇貝閉殼肌出現(xiàn)膿胞的主要致病病原。筆者通過病毒粒子的病原學相關研究和流行病學調(diào)查結(jié)果也認為高溫與蝦夷扇貝大規(guī)模死亡有一定相關性，而病毒不是導致蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的主要原因[15]。總體看，扇貝大規(guī)模死亡是環(huán)境條件、病害、養(yǎng)殖密度、種質(zhì)等多方面因素綜合造成的。

長?？h筏養(yǎng)蝦夷扇貝大規(guī)模死亡雖然也和水溫、病害、養(yǎng)殖密度、種質(zhì)等多方面因素相關，但造成蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的真正病因尚未見詳細系統(tǒng)的研究報道。筆者從與筏養(yǎng)蝦夷扇貝大規(guī)模死亡相關的主要因素中選取水溫、饑餓和病害三個因素進行初步研究分析，探討該海域蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的病因，為防治其大規(guī)模死亡提供參考。

1 材料與方法

1.1 筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)調(diào)查及樣品采集

1.1.1 筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)浮游植物豐度調(diào)查

(1)樣品采集

2015年4—9月，在大長山島小泡子村筏式蝦夷扇貝養(yǎng)殖海區(qū)(北緯39°15′10.74″～39°15′34.02″，東經(jīng)122°32′55.50″～122°34′13.26″)設定5個調(diào)查站位(圖1)，每月采樣一次，采樣水層為4 m(筏式蝦夷扇貝養(yǎng)殖水深一般為3～5 m)。

圖1 筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)浮游植物調(diào)查站位

(2)按照國家海洋調(diào)查規(guī)范(GB/T 12763.6-2007)[16]進行采樣分析，浮游植物優(yōu)勢度根據(jù)其出現(xiàn)的頻率及豐度計算[17]，計算公式為：

Y=(ni/N)×fi

式中，Y為優(yōu)勢度，ni為第i個種的豐度，N為樣品總豐度，fi為該種的站位出現(xiàn)頻率。以Y≥0.02確定為優(yōu)勢種類。

1.1.2 筏養(yǎng)蝦夷扇貝死亡數(shù)量統(tǒng)計和水溫實時監(jiān)測

1.1.2.1 蝦夷扇貝死亡數(shù)量和膿胞數(shù)量統(tǒng)計

2015年4—9月，每月取樣一次，統(tǒng)計蝦夷扇貝死亡情況，每個站位取3籠養(yǎng)殖扇貝(2015年4月分苗，共1200枚)進行死亡率統(tǒng)計分析。累計死亡率分析參考文獻[18]的方法，月平均死亡率的分析處理參考文獻[19]的方法。每個站位解剖30枚扇貝，統(tǒng)計出現(xiàn)膿胞的扇貝個數(shù)。

1.1.2.2 水溫實時監(jiān)測

2015年4—9月，在筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)，利用Seabird SBE56水下溫度儀進行連續(xù)不間斷水溫實時監(jiān)測。測量周期2 h一次，測量水深3 m。

1.2 同水溫條件不同單細胞餌料密度模擬養(yǎng)殖試驗

1.2.1 試驗材料和日常管理

1.2.1.1 試驗材料和時間

試驗用蝦夷扇貝來自選育家系,在長?？h小長山島海洋島集團所屬海區(qū)進行養(yǎng)成。扇貝殼高5～7 cm，2016年6月21日開始在遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院海水引育種中心暫養(yǎng)，8月2日試驗結(jié)束，各試驗組試驗周期約30 d。

1.2.1.2 水溫控制和日常管理

2016年6月17日引進試驗用蝦夷扇貝，控制暫養(yǎng)池水溫在14 ℃,每日升溫1 ℃。水溫升至17 ℃，從暫養(yǎng)池選擇健康有活力的蝦夷扇貝進行第一組溫度梯度試驗，水溫升至19 ℃和22 ℃時，進行第二和第三組溫度梯度試驗。為保證試驗蝦夷扇貝處于相同餌料水平，暫養(yǎng)期間不投餌。

1.2.2 試驗組別設置

制冷機循環(huán)水設備控溫的7 ℃冷水和常溫海水混合，配置14 ℃、18 ℃和22 ℃海水，由于室溫和水體較小原因，日均水溫有一定波動，3個溫度區(qū)間試驗組為14～17 ℃、18～20 ℃和22～24 ℃；每個溫度區(qū)間條件下，設置3個單胞藻餌料密度投喂組：0 個/L(饑餓組)、107個/L組和108個/L組。每組設3個平行，每個平行15枚扇貝。

試驗在80 L的圓筒中進行，試驗基地培養(yǎng)餌料密度為1.6×106個/mL，根據(jù)餌料投喂密度每個試驗組每次分別投喂新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)0 mL，500 mL和5 L。投喂3次/d，換水1次/d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗過程中統(tǒng)計各試驗組每天蝦夷扇貝死亡個數(shù)，解剖扇貝，統(tǒng)計閉殼肌中有膿胞出現(xiàn)扇貝個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)浮游植物豐度

2.1.1 浮游植物種群構成

2015年4—9月，筏養(yǎng)蝦夷扇貝海區(qū)浮游植物優(yōu)勢種以硅藻類為主(表1)。4月和5月的優(yōu)勢種為柔弱幾內(nèi)亞藻(Guinardiadelicatula)和具槽直鏈藻(Paraliasulcata)。4月兩種藻類優(yōu)勢度為0.88和0.06；5月兩種藻類優(yōu)勢度為0.85和0.04;6月優(yōu)勢種為中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和丹麥細柱藻(Leptocylindrusdanicus),優(yōu)勢度為0.28和0.17；7月優(yōu)勢種為中肋骨條藻、丹麥細柱藻、具槽直鏈藻、海洋原甲藻(Prorocentrummicans)、菱形藻(Nitzschia)和圓柱角毛藻(Chaetocerosteres),優(yōu)勢度為0.33、0.15、0.13、0.11、0.09和0.03；8月優(yōu)勢種為丹麥細柱藻和短角彎角藻(Eucampiazodiacus)，優(yōu)勢度為0.71和0.2；9月優(yōu)勢種為柔弱偽菱形藻(Pseudonitzschiadelicatissima)、旋鏈角毛藻(C.curvisetus)和具槽直鏈藻，優(yōu)勢度為0.13、0.09和0.06。

2.1.2 浮游植物豐度

2015年4—9月，調(diào)查海區(qū)浮游植物豐度月度變化趨勢為4月最高，密度為16.65×105個/L。 5—7月連續(xù)下降，5月為8.45×105個/L,6月為4.14×105個/L，7月為2.27×105個/L,8月數(shù)量有所回升，達到8.18×105個/L，9月浮游植物豐度又大幅下降，僅為0.6×105個/L(圖2)。

2.2 扇貝死亡數(shù)量和水溫監(jiān)測

2.2.1 蝦夷扇貝死亡數(shù)量統(tǒng)計

2015年4—9月，調(diào)查海域的二齡蝦夷扇貝死亡率和膿胞出現(xiàn)個數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果見表2。4月，蝦夷扇貝以每層20枚扇貝(殼高5～6 cm)的密度裝入20層板養(yǎng)殖籠，9月底統(tǒng)計時累計死亡率達到91%；利用四格表卡方檢驗各月平均死亡率， 6—7月月平均死亡率最高，達到57.9%(P<0.05),出現(xiàn)膿胞個數(shù)也最多；8—9月月死亡率為53.7%。因此死亡最高峰發(fā)生在6—7月，但8—9月高溫期扇貝死亡率也很高。

圖2 2015年4—9月大長山島蝦夷扇貝浮筏養(yǎng)殖海區(qū)浮游植物豐度月度變化

表1 2015年4—9月浮筏蝦夷扇貝海區(qū)浮游植物優(yōu)勢種

表2 2015年4—9月筏養(yǎng)蝦夷扇貝死亡情況統(tǒng)計

注：表格中同列肩標相同表示差異不顯著(P>0.05).

2.2.2 海區(qū)水溫實時變化

2015年4—9月，調(diào)查海區(qū)水溫變化見圖3、圖4。

圖3 2015年6月17日—7月22日水溫變化

圖4 2015年8月14日—9月22日水溫變化

6—7月，日水溫變化在16.29～20.19 ℃，月平均水溫18.06 ℃；8—9月，日水溫變化在22.09～23.78 ℃，日平均水溫超過23 ℃的天數(shù)達到23 d。

2.3 室內(nèi)不同溫度不同餌料密度養(yǎng)殖試驗結(jié)果

18～20 ℃溫度區(qū)間饑餓組的死亡率及膿胞出現(xiàn)比例最高(P<0.05)；在任一餌料密度組，3個溫度區(qū)間組的蝦夷扇貝死亡率均有顯著差異，18～20 ℃溫度區(qū)間組死亡率最高,22～24 ℃溫度區(qū)間組死亡率次之,14～17 ℃溫度區(qū)間組死亡率最低。膿胞出現(xiàn)比例在18～20 ℃溫度區(qū)間最高，但其他兩個溫度區(qū)間組膿胞出現(xiàn)比例差異不顯著；在18～20 ℃溫度區(qū)間，饑餓組蝦夷扇貝死亡率和膿胞出現(xiàn)比例均為最高，但在2個溫度區(qū)間，3個單細胞餌料(饑餓、107個/L組和108個/L組)，死亡率和膿胞出現(xiàn)比例無顯著性差異(表3)。

統(tǒng)計模擬養(yǎng)殖試驗進程中3個溫度區(qū)間組每日蝦夷扇貝總死亡個數(shù)(圖5)，進行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)14～17 ℃溫度區(qū)間和18～20 ℃溫度區(qū)間蝦夷扇貝的死亡規(guī)律比較相似，相關系數(shù)分別為0.881和0.8795，而22～24 ℃溫度區(qū)間蝦夷扇貝死亡規(guī)律和另外2個溫度區(qū)間組不相同，相關系數(shù)為0.9884。表明死亡原因可能有所差異，22～24 ℃溫度區(qū)間出現(xiàn)的膿胞比例和14～17 ℃溫度區(qū)間雖然沒有顯著性差異，但此時膿胞和14～17 ℃溫度區(qū)間的相比更加明顯，很可能是病灶發(fā)展的結(jié)果，并非新產(chǎn)生的膿胞。

表3 室內(nèi)模擬養(yǎng)殖不同試驗組蝦夷扇貝死亡情況和膿胞出現(xiàn)個數(shù)統(tǒng)計

注：表格中同行肩標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05).

3 討 論

3.1 水溫對蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的影響

研究顯示，在環(huán)境因子良好的情況下，海水溫度過高可導致櫛孔扇貝死亡，且扇貝死亡率隨著高溫刺激時間的延長呈上升趨勢[20-21]。日本蝦夷扇貝在20世紀70年代曾發(fā)生過大規(guī)模死亡，夏季的高水溫，使已經(jīng)出現(xiàn)生理障礙的扇貝對環(huán)境變化的抵抗力減弱，同樣被認為是大規(guī)模死亡的主要原因之一[22]。本研究探討水溫和蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的聯(lián)系，根據(jù)室內(nèi)模擬養(yǎng)殖試驗結(jié)果和海區(qū)流行病學調(diào)查結(jié)果，高水溫不是導致蝦夷扇貝開始死亡的直接原因，17 ℃左右的水溫可能是蝦夷扇貝開始死亡的起始溫度，當水溫高于17 ℃，蝦夷扇貝月平均死亡率開始大幅提高[15]。本研究中2015年6月17日—7月22日的蝦夷扇貝月平均死亡率最高，此時海水溫度為16.29～20.19 ℃，室內(nèi)模擬養(yǎng)殖試驗中18～20 ℃區(qū)間組死亡率同樣最高，蝦夷扇貝死亡率最高時期的水溫未超出其適宜生長水溫范圍，表明高水溫不是6—7月蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的原因；進入8—9月，海區(qū)水溫達到最高值，但膿胞出現(xiàn)比例卻顯著低于6—7月，但由于日平均水溫超過23 ℃ 的時間連續(xù)達到23 d，蝦夷扇貝月平均死亡率達到53.7%，僅略低于6—7月的月平均死亡率；室內(nèi)22～24 ℃溫度區(qū)間組的膿胞出現(xiàn)比例也低于18～20 ℃溫度區(qū)間組，但由于高溫刺激，蝦夷扇貝的死亡率也僅略低于18～20 ℃溫度區(qū)間組。說明高水溫尤其是連續(xù)高溫刺激加劇了蝦夷扇貝大規(guī)模死亡。總體而言，長?？h水溫變化和蝦夷扇貝大規(guī)模死亡密切相關，17 ℃左右的水溫是蝦夷扇貝開始大規(guī)模死亡的重要節(jié)點，而高水溫不是導致蝦夷扇貝開始大規(guī)模死亡的原因，但在8—9月期間加劇了扇貝死亡。

圖5 3個溫度區(qū)間組蝦夷扇貝存活扇貝個數(shù)趨勢比較

3.2 饑餓對蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的影響

Navarro等[23-24]認為，大規(guī)模養(yǎng)殖浮筏會形成一定屏障效益，導致養(yǎng)殖區(qū)餌料供應不足，造成扇貝的營養(yǎng)障礙機體能量收支失衡，引發(fā)抗性下降，易受病原侵入。長海縣蝦夷扇貝浮筏養(yǎng)殖面積最高達到2.7×104hm2，截至2016年仍有1.0×104hm2，且筏間距越來越小，筏身長度越來越長，每層扇貝養(yǎng)殖數(shù)量也很多，同時海區(qū)牡蠣養(yǎng)殖和海灣扇貝養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，因此對海區(qū)環(huán)境承載力的壓力仍然很大。這可能會導致海區(qū)餌料嚴重不足，扇貝體質(zhì)變?nèi)酰l(fā)病害。

本試驗從調(diào)查海區(qū)浮游植物豐度月度變化入手，發(fā)現(xiàn)海區(qū)浮游植物主要優(yōu)勢種主要為硅藻,豐度變化則比較明顯，4月最高，隨后急劇下降，5—7月份逐步降低，8月略有上升，這與付成東等[25]對長?？h浮游植物豐度的調(diào)查結(jié)果一致。5—7月，蝦夷扇貝排卵后需要大量攝食補充營養(yǎng)，也是蝦夷扇貝生長最快，濾水率最高的時期，此時浮游植物豐度的大幅下降可能會導致扇貝餌料不足。通過室內(nèi)模擬養(yǎng)殖試驗，在不同水溫不同餌料條件下，18～20 ℃溫度區(qū)間的饑餓組膿胞出現(xiàn)比例和死亡率最高，而在另外兩個溫度區(qū)間組，不同餌料密度組在死亡率和膿胞出現(xiàn)比例方面沒有顯著差異。這說明單純饑餓并不能導致扇貝大規(guī)模死亡，14～17 ℃溫度區(qū)間表現(xiàn)出差異的可能原因為此時病原剛剛開始侵襲宿主，不同餌料密度雖然使蝦夷扇貝對病原的抵抗力有所不同，但在這個溫度區(qū)間，病原毒力相對較弱，且剛開始感染，因此饑餓組在死亡率和膿胞出現(xiàn)比例方面未與另外2個餌料密度組表現(xiàn)出顯著性差異。22～24 ℃溫度區(qū)間表現(xiàn)出差異的可能原因是在此溫度區(qū)間，扇貝的濾水率和攝食率都很低，不同餌料密度組造成的差異相對較小，而這段溫度區(qū)間高水溫和病害都是造成蝦夷扇貝死亡的主要原因。

3.3 病害對蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的影響

近幾十年，我國海洋貝類養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅速，養(yǎng)殖貝類大規(guī)模死亡問題日益嚴重，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、貽貝(Mytilusedulis)、櫛孔扇貝都因為病害問題發(fā)生過大規(guī)模死亡[26]。長?？h自2007發(fā)生風暴潮以后，筏養(yǎng)蝦夷扇貝也連續(xù)多年發(fā)生大規(guī)模死亡。根據(jù)流行病學調(diào)查，蝦夷扇貝出現(xiàn)膿胞是死亡扇貝典型癥狀[15]，因此本研究將膿胞作為病害發(fā)生的標記。2015年4—9月的海區(qū)調(diào)查結(jié)果顯示蝦夷扇貝月死亡率最高的時期是6—7月，膿胞出現(xiàn)個數(shù)也最高；而室內(nèi)模擬養(yǎng)殖試驗結(jié)果同樣表明，蝦夷扇貝死亡率最高的試驗組膿胞出現(xiàn)比例也最高，這說明膿胞出現(xiàn)個數(shù)最多時，也是扇貝死亡最嚴重的時期，病害和扇貝死亡密切相關；由于蝦夷扇貝大規(guī)模死亡具有典型的周期性(在適宜水溫開始出現(xiàn)死亡，每年在6—9月期間1齡至2齡養(yǎng)成期蝦夷扇貝都會發(fā)生大規(guī)模死亡)、具有典型發(fā)病癥狀(閉殼肌出現(xiàn)膿胞)，并且在扇貝大規(guī)模死亡各個時期均能發(fā)現(xiàn)膿胞，因此病害很可能是導致蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的主要直接原因。

3.4 水溫、饑餓和病害對蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的共同影響

大規(guī)模高密度養(yǎng)殖導致餌料不足，進一步導致蝦夷扇貝對病原的抵抗力和對環(huán)境的耐受力都開始下降，在適當水溫條件下，病原感染蝦夷扇貝，宿主開始大規(guī)模死亡，同時由于高溫脅迫，加劇了蝦夷扇貝死亡。根據(jù)本研究結(jié)果，在14～17 ℃溫度區(qū)間和18～20 ℃溫度區(qū)間組蝦夷扇貝的死亡規(guī)律比較相似，相關系數(shù)比較相近，此時病害起主要作用;在22～24 ℃溫度區(qū)間，相關系數(shù)顯著變大，扇貝死亡速度明顯加快，雖然22～24 ℃溫度區(qū)間出現(xiàn)的膿胞比例和14～17 ℃溫度區(qū)間雖然沒有顯著性差異，但此時膿胞和14～17 ℃溫度區(qū)間的相比更加明顯，很可能是病灶發(fā)展的結(jié)果，并不是新產(chǎn)生的膿胞。因此，22～24 ℃溫度區(qū)間組蝦夷扇貝的死亡是病害和高溫共同作用結(jié)果。蝦夷扇貝大規(guī)模死亡是在餌料不足的條件下，病害和水溫兩個因素是扇貝死亡不同階段的關鍵原因。6—7月，適宜水溫條件下(約17 ℃)，病害是蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的主要直接原因。8—9月，高水溫和病害共同導致蝦夷扇貝大規(guī)模死亡。

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