周 潔, 趙麗娟, 陶凌云, 胡建華, 高 誠

(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

鼠痘病毒(ectromelia virus，ECTV)屬于痘病毒科正痘病毒屬，是引起小鼠鼠痘(ECT)病原體。1930年英國的Marchal在實(shí)驗(yàn)鼠群中最早發(fā)現(xiàn)了患該病的小鼠足部缺失的特征明顯, 她將這種病稱為傳染性脫腳病(infectious ectromelia), 1947年Fenner將本病命名為鼠痘[1]。ECTV粒子呈磚形或卵圓形，大小為230 nm×170 nm, 由1個(gè)核心、2個(gè)側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成, 是動(dòng)物病毒中體積大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的DNA病毒。該病毒基因組為雙股DNA，長度180～200 kb, 編碼200多種蛋白，基因組具有較長的約5 kb端重復(fù)序列(TTRS)，這一結(jié)構(gòu)可能與病毒繁殖方式有關(guān)[2]。ECT的臨床癥狀分為三種:急性感染的小鼠很快死亡; 慢性感染的小鼠最早出現(xiàn)的可見病變位置通常在面部、鼻、足或腹部，均伴有潰瘍性病灶，病鼠散在性連續(xù)性死亡，剖檢死亡小鼠可見肝臟、腎臟的出血性壞死; 脾臟腫大;淋巴結(jié)變大并時(shí)常伴有小腸出血。潛伏感染的小鼠不表現(xiàn)臨床癥狀, 潛在的病毒可在應(yīng)激條件下爆發(fā)。目前ECTV廣泛存在于世界各國，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)小鼠的繁育生產(chǎn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行以及科研數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[3]。本文側(cè)重于對(duì)ECTV感染機(jī)制、免疫應(yīng)答及診斷等方面進(jìn)行闡述。

1 ECTV的遺傳抗性

早期研究[4]表明，ECT的抗病性取決于感染途徑、感染病毒的毒性和小鼠的基因型。近交系小鼠分為對(duì)ECTV感染抗病型和ECTV易感型。易感品系如BALB/c、A和DBA/2，不能控制病毒的復(fù)制和傳播，因而常發(fā)生不可控的肝壞死而最終死亡。另一方面，具有遺傳抗性的小鼠品系，如AKR、C57BL/6(B6)以及某些129品系小鼠的致病性和致死率較低。Orlowski等[5]研究認(rèn)為樹突狀細(xì)胞(DCs)是將先天免疫系統(tǒng)與適應(yīng)性免疫應(yīng)答相連的效應(yīng)細(xì)胞， BALB/c小鼠感染ECTV后病毒消除DCs以防止宿主反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫抑制并維持慢性感染有助于病毒的傳播。Dolega等[6]研究了BALB/c和C57BL/6小鼠感染ECTV-Mos后腹膜巨噬細(xì)胞中先天免疫基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，揭示了基因表達(dá)的差異可能決定了BALB/c和C57BL/6小鼠對(duì)ECTV-Mos的致死感染的抵抗/易感性的差異。Cheng等[7]分別取感染ECTV后3～10 d的BALB/c和C57BL/6小鼠脾臟做基因芯片，分析二者的基因差異表達(dá)，結(jié)果顯示易感型BALB/c小鼠相對(duì)產(chǎn)生更多的差異表達(dá)基因，這些基因參與先天免疫、細(xì)胞凋亡、代謝和癌癥相關(guān)的通路，而C57BL/6抗病小鼠差異表達(dá)基因主要參與促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移。

在ECT小鼠模型中, 普遍觀點(diǎn)認(rèn)為近交系小鼠的遺傳抗性是由多種不相關(guān)聯(lián)的常染色體顯性基因控制。位于6號(hào)染色體上的鼠痘抗性基因1(Rmp-1)控制病毒在肝臟中的復(fù)制, 與自然殺傷細(xì)胞基因復(fù)合體(NKC)相關(guān)。鼠痘抗性基因2(Rmp-2)位點(diǎn)在2號(hào)染色體上，與補(bǔ)體C5基因相關(guān)。ECTV感染時(shí)，其對(duì)雌性小鼠的保護(hù)要強(qiáng)于雄性小鼠。C5基因缺陷小鼠，如DBA/2小鼠，感染時(shí)感染部位產(chǎn)生白細(xì)胞增多現(xiàn)象。而鼠痘抗性基因3(Rmp-3)連接在主要的組織相容性復(fù)合體(MHC)(H-2)上，通過CD8T細(xì)胞表達(dá)其功能，在感染后恢復(fù)中起到關(guān)鍵作用。鼠痘抗性基因4(Rmp-4)參與編碼性腺依賴功能基因，與選擇素基因復(fù)合體有關(guān)。ECTV天然抗病性機(jī)理在易感染品系感染后3 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，在感染期間細(xì)胞內(nèi)serpinb9通過是維持成熟自然殺傷細(xì)胞和活化CD8T細(xì)胞與ECTV對(duì)抗[8-11]。

2 ECTV的免疫應(yīng)答

免疫應(yīng)答過程可以籠統(tǒng)分為固有免疫應(yīng)答期和適應(yīng)性免疫應(yīng)答期兩個(gè)階段。在病毒入侵時(shí)，大多非特異性固有免疫應(yīng)答在早期感染中被快速激發(fā)以保護(hù)宿主, 阻止感染進(jìn)一步發(fā)生，同時(shí)等待特異性抗原應(yīng)激緩慢的產(chǎn)生。ECTV的免疫和恢復(fù)很大程度上同時(shí)依賴于各種不同來源的固有免疫應(yīng)激和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括自然殺傷細(xì)胞、CD4和CD8 T淋巴白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、氮氧化合物、輔助性T細(xì)胞1型和α、β、γ-干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)的效應(yīng)器功能[12]。有研究[13-15]表明, B 細(xì)胞和抗體在ECTV感染的控制和恢復(fù)中亦有關(guān)鍵性作用。

2.1 ECTV初期感染中抗體的作用

很長一段時(shí)期內(nèi)，研究者對(duì)痘病毒的應(yīng)激反應(yīng)研究的重點(diǎn)都在T細(xì)胞效應(yīng)器功能的作用上，而忽略了B細(xì)胞的功能。早期研究ECTV感染的B6小鼠得出的結(jié)論認(rèn)為B細(xì)胞和抗體的作用或許來自T細(xì)胞的調(diào)亡[13]。單克隆抗體修飾的CD8(+)細(xì)胞亞型在ECTV感染的B6小鼠中的調(diào)亡抵消了細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的應(yīng)激反應(yīng)，使小鼠不能清除病毒，因而大部分小鼠被ECTV感染后10 d死亡。另一方面，CD4T細(xì)胞的調(diào)亡導(dǎo)致非最佳條件的CTL應(yīng)激反應(yīng)，造成對(duì)病毒的控制和抵抗變得很弱。CD4T細(xì)胞的重要作用是幫助CTL的應(yīng)激反應(yīng)功能，因此，缺乏CD4T細(xì)胞會(huì)造成CTL抗病毒應(yīng)激減弱。CTL的應(yīng)激反應(yīng)即使在感染的最后階段仍能對(duì)病毒產(chǎn)生抵抗，但不足以清除病毒。類似反應(yīng)也曾在缺乏MHC 2類分子的感染小鼠體內(nèi)觀察到，MHC 2類分子在感染后26 d仍能在主要器官呈現(xiàn)耐病毒能力，與缺乏CD8T細(xì)胞的感染后很快就死亡的動(dòng)物不一樣的是，這些小鼠在感染后12～14 d長出表皮點(diǎn)狀潰瘍。小鼠無論是CD4T缺乏還是MHC 2類分子缺乏，都不能產(chǎn)生中和抗體,因此這些動(dòng)物缺乏CD4T淋巴細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用的能力[12]。Reynolds 等[16]的研究認(rèn)為, 多數(shù)痘病毒都表達(dá)一個(gè)約分子量200 000的膜蛋白同系物，在ECTV病毒中稱作C15蛋白, 可調(diào)節(jié)感染ECTV小鼠的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的免疫活性。將C15蛋白基因N-末端附近具有終止密碼子的突變病毒注射到BALB/c小鼠足墊中, 死亡率比對(duì)照病毒組降低，免疫組織化學(xué)分析試驗(yàn)也證實(shí)在腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肝臟中突變體病毒數(shù)量較對(duì)照病毒少, 表明突變病毒擴(kuò)散和復(fù)制減少。Szulc-D?browska等[17]研究了ECTV感染對(duì)小鼠骨髓來源(GM-BM)細(xì)胞，包括常規(guī)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響，結(jié)果表明ECTV能夠在GM-BM細(xì)胞中復(fù)制并嚴(yán)重?fù)p害其先天適應(yīng)性免疫功能，表現(xiàn)為細(xì)胞細(xì)胞的形態(tài)變化較大，在感染晚期細(xì)胞凋亡加劇。此外，細(xì)胞不能攝取、加工、處理抗原從而形成完全的炎癥反應(yīng)。因此，GM-BM細(xì)胞無法在原發(fā)性混合白細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中刺激異源性CD4+T細(xì)胞增殖。也就是說ECTV誘導(dǎo)GM-BM使其產(chǎn)生功能性免疫機(jī)制麻痹，從而影響其啟動(dòng)下游的T細(xì)胞的激活能力。

2.2 ECTV二級(jí)感染中抗體的作用

研究[18]表明缺乏胸苷激酶的無毒性ECTV病毒株的復(fù)制比野生型毒株效率低，能引起細(xì)胞修飾和抗體應(yīng)激，但在感染后4周動(dòng)物體內(nèi)就無法再檢測(cè)到病毒。而正常的易感近交系小鼠品系，例如BALB/c，如果一開始接種無毒性毒株，那在感染野生型ECTV后能引發(fā)大量針對(duì)ECTV的免疫應(yīng)激反應(yīng)并最終清除病毒。

MHC、CD40和μMT基因敲除(MHC II, CD40和μMT)的小鼠, 一般對(duì)野生型ECTV易感, 但感染無毒性ECTV毒株后可完全恢復(fù)。但是當(dāng)這些小鼠經(jīng)過二級(jí)野生ECTV感染時(shí)，就失去了產(chǎn)生大量中性抗體應(yīng)激反應(yīng)的能力，機(jī)體控制病毒的能力變?nèi)鯊亩赘猩踔林滤溃c未進(jìn)行無毒性毒株感染實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物類似。這表明B細(xì)胞的存在、CD4T細(xì)胞協(xié)同B細(xì)胞的相互作用以及后續(xù)抗體的產(chǎn)生, 是ECTV初期和二級(jí)感染中恢復(fù)的重要因素[17]。在痘病毒感染引起應(yīng)激反應(yīng)時(shí), 一系列免疫因素, 包括CD4T和CD8T 淋巴細(xì)胞, IFN-α、IFN-β、IFN-γ和中性抗體都具有重要作用。不同的是, 二級(jí)感染的有效應(yīng)激很大程度上取決于B細(xì)胞的應(yīng)激和特異性病毒抗體[19]。在ECTV研究[20]中發(fā)現(xiàn)IFN在宿主應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用, ECTV作為一種小鼠易感病原體能和宿主共同進(jìn)化, 它能編碼IFN分泌型受體的同源染色體，這并不是ECTV的獨(dú)有特征, 其它痘病毒也能編碼和調(diào)整宿主IFN受體的信號(hào)表達(dá)途徑。

3 病毒感染的致病機(jī)理

以往認(rèn)為ECTV可以通過皮膚上的傷口或者污染物直接在動(dòng)物之間傳播，例如鼠籠的污染。研究[21]表明ECTV最常通過鼠足墊的傳播而引起感染，病毒在動(dòng)物感染部位表皮復(fù)制和釋放病毒性傳代物質(zhì)直至傳播至淋巴結(jié)、血液和其它器官。

當(dāng)通過皮下途徑感染時(shí)，ECTV在感染位點(diǎn)復(fù)制，然后擴(kuò)散至淋巴結(jié)病毒繼續(xù)復(fù)制。病毒侵入血液后引發(fā)一級(jí)病毒血癥使病毒進(jìn)入脾臟和肝臟，在這些部位壞死細(xì)胞釋放更多病毒再進(jìn)入血液引發(fā)二級(jí)病毒血癥，二級(jí)病毒血癥是導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)點(diǎn)狀潰瘍的因素。這些潰瘍與人類感染天花時(shí)的臁瘡表現(xiàn)類似，其繼續(xù)作為感染源在表皮感染，也是作為傳播疾病的重要途徑。小鼠易感品系的死因通常是由于肝壞死，常常出現(xiàn)在感染后8～10 d，與小鼠體內(nèi)最高病毒滴度產(chǎn)生的時(shí)間相一致。

4 鼠痘的檢測(cè)和防控

抗體檢測(cè)方法有血凝抑制試驗(yàn)(HAI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和免疫酶試驗(yàn)(IEA)等。1980年代開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)的初期, 國內(nèi)普遍采用HAI方法, 該方法對(duì)為預(yù)防ECT而接種牛痘苗的小鼠血清不呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，但HAI法存在假陰性, 現(xiàn)已不采用。1990年代以后，IFA、IEA 和ELISA等開始應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè), 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ECTV檢測(cè)方法“GB/T 14926.2001-20”規(guī)定了ECTV檢測(cè)方法，其中有“GB/T 14926.2001-50 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、GB/T 14926.2001-51 免疫酶試驗(yàn)、GB/T 14926.2001-52 免疫熒光試驗(yàn)、GB/T 14926.2001-55 免疫組織化學(xué)法”。其中各檢測(cè)機(jī)構(gòu)普遍采用間接ELISA方法，IFA可以檢出早期的抗體水平，也是目前較為常用的抗體檢測(cè)方法。對(duì)ECTV抗原檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是采用病理切片，顯微鏡下觀察可見的典型痘病毒顆粒和痘病毒包涵體。另外, 把病毒分離接種于雞胚絨毛尿囊腔傳代后應(yīng)產(chǎn)生融合性病灶，將其磨碎可產(chǎn)生特征性血球凝聚反應(yīng)。潛伏感染的小鼠不易檢出抗體, 通常建議采用免疫酶組織化學(xué)法(HI)或PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。PCR技術(shù)檢測(cè)ECT病毒在國內(nèi)的報(bào)道首先出現(xiàn)于1998年[22], 可檢出0.1 pg的ECT病毒基因。2016年Wang等[23]建立了一種基于原位雜交的量子點(diǎn)熒光檢測(cè)方法, 使用biotin-dUTP替代dTTP，在聚合酶鏈反應(yīng)期間將生物素?fù)饺隓NA探針中用于檢測(cè)ECTV基因組DNA。

目前尚無治療ECT有效方法，對(duì)于ECT,關(guān)鍵在于預(yù)防，而預(yù)防ECT最重要的是環(huán)境設(shè)施建設(shè)和管理的加強(qiáng)。建立嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫制度，SPF級(jí)環(huán)境設(shè)施的規(guī)范運(yùn)行是目前控制ECT流行最有效途徑。對(duì)于有ECT爆發(fā)的鼠群應(yīng)采取全群淘汰原則，疑似病例的發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時(shí)上報(bào)并診斷以采取防控措施。ECT的爆發(fā)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)、干擾動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。無可見臨床癥狀的潛伏期感染小鼠則是鼠群的一項(xiàng)巨大隱患，因此加強(qiáng)ECT病毒的檢測(cè)必不可少。國外最新研究[24]表明，利用痘病毒種屬間基因高同源性的特點(diǎn)，用多價(jià)天花病毒DNA疫苗免疫小鼠，再用缺失6個(gè)靶向基因的重組痘苗病毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可以保護(hù)小鼠免受150 LD50劑量的ECTV攻擊。

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