李開(kāi)心　劉彥妮　于寶佳　岳潔瑜　王華忠

摘 要：細(xì)胞內(nèi)自噬水平監(jiān)測(cè)方法的建立是深入揭示自噬調(diào)控機(jī)制和生理功能的重要基礎(chǔ)。ATG8蛋白定位于自噬小體膜上，對(duì)其熒光蛋白標(biāo)記分子的熒光觀(guān)察是監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬發(fā)生水平的重要方法。本研究選擇小麥ATG8家族的TaATG8h基因，構(gòu)建了GFP-TaATG8h和DsRED-TaATG8h融合基因表達(dá)載體，載體構(gòu)建的正確性得到酶切和測(cè)序結(jié)果的確認(rèn)；以易于轉(zhuǎn)化的小麥原生質(zhì)體為受體，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)融合基因在原生質(zhì)體細(xì)胞中的高效表達(dá)，在表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞中觀(guān)察到了清晰的熒光。本研究結(jié)果為在重要農(nóng)作物小麥上建立以ATG8為靶標(biāo)的自噬水平監(jiān)測(cè)技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；細(xì)胞自噬；ATG8；原生質(zhì)體

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.004

Abstract： The establishment of autophagy monitoring method was important for revealing the regulation mechanisms and physiological functions of autophagy. ATG8 locates on autophagosome membranes and its fluorescent protein-tagged forms have been successfully used to monitor autophagy level in cells. In this study， TaATG8h， one member of the wheat ATG8 family， was selected and GFP-TaATG8h and DsRED-TaATG8h fusion gene expression vectors were constructed. The correctness of constructed vectors was confirmed by results of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Wheat protoplasts， which were easily transformed with genes， were used to express the two fusion genes， and clear fluorescence was observed in the cells expressing fusion proteins. The results of this study laid a foundation for establishing ATG8-based autophagy monitoring technology and for exploring the role of autophagy in the important crop species of wheat.

Key words：wheat； autophagy； ATG8； protoplast

細(xì)胞自噬（autophagy）是真核生物細(xì)胞內(nèi)一種保守的物質(zhì)分解和循環(huán)利用機(jī)制。在自噬過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)待降解底物被包裹進(jìn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，隨著自噬小體外膜與液泡（動(dòng)物是溶酶體）膜的融合，內(nèi)膜及包裹的底物（此時(shí)稱(chēng)為自噬小泡）進(jìn)入液泡腔被分解[1-3]。多種自噬相關(guān)因子（autophagy-related factor，ATG）參與到自噬小體組裝、底物選擇、自噬小體與液泡的融合及這其中的信號(hào)調(diào)控等過(guò)程。ATG8是自噬核心機(jī)制中研究得最清楚的ATG因子，其通過(guò)一個(gè)類(lèi)泛素化過(guò)程與脂類(lèi)分子磷脂酰乙醇胺（PE）連接形成ATG8-PE定位于自噬小體內(nèi)、外膜表面，藉此征集其他ATG因子推動(dòng)自噬小體膜的起始、延伸、合攏及與液泡的融合等過(guò)程[4-6]。細(xì)胞內(nèi)自噬水平的監(jiān)測(cè)是開(kāi)展自噬分子機(jī)制和生理功能研究的必要手段。鑒于A(yíng)TG8對(duì)自噬小體膜的標(biāo)志性裝飾，其被熒光蛋白標(biāo)記后在細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀熒光可作為觀(guān)察指標(biāo)來(lái)表征細(xì)胞內(nèi)的自噬小體積累情況，從而反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生水平[7]。目前此類(lèi)方法已經(jīng)在酵母、動(dòng)物和模式植物擬南芥、水稻上得到應(yīng)用[8-9]，但在重要農(nóng)作物小麥上還未見(jiàn)報(bào)道。

酵母只有一個(gè)ATG8，而高等生物ATG8則是由多個(gè)成員構(gòu)成的基因家族。此前，我們?cè)谛←溕翔b定了9個(gè)ATG8（TaATG8a-8h）基因，證實(shí)他們參與了小麥的細(xì)胞自噬過(guò)程[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了小麥TaATG8h的GFP和DsRED融合基因表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了融合基因在小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中的高效表達(dá)，旨在為在小麥上建立以ATG8為靶標(biāo)的自噬水平監(jiān)測(cè)技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

小麥TaATG8h由本實(shí)驗(yàn)室克隆，其全長(zhǎng) cDNA保存于 pLB-ATG8h載體上。以載體pA7-GFP為基礎(chǔ)構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，該載體上含有XbaⅠ和SacⅠ位點(diǎn)用于插入目標(biāo)基因并與GFP融合。設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增TaATG8h完整ORF的引物對(duì)8h-F（GCTCTAGAAATGA AGTCCTTCAAGAAGGA）/8h-R（CGAGCTCTCACCCAAATGTCTTCTCGC）。使用該引物對(duì)和pfu DNA聚合酶，以pLB-ATG8h質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物和pA7-GFP質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ/SacⅠ雙酶切后進(jìn)行連接。使用酶切和測(cè)序方法鑒定重組克隆，隨后將構(gòu)建的GFP-TaATG8h融合基因表達(dá)載體命名為pGFP-A8h。DsRED-TaATG8h融合基因表達(dá)載體pRED-A8h的構(gòu)建是以pGFP-A8h為基礎(chǔ)，將該載體上的GFP基因替換為DsRED基因。其過(guò)程為：使用引物對(duì)DsRed-F（CCGCTCGAGATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATCA） /DsRed-R（GCTCTAGAGCCAGGAACAGGTGGTGGCGGC）從pHBT-DsRed-NOS載體上擴(kuò)增不含終止密碼子的DsRED基因ORF序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切后替換pGFP-A8h載體上的GFP基因ORF。構(gòu)建的pRED-A8h載體經(jīng)酶切和測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （Qiagen）提取pGFP-A8h和pRed-A8h載體質(zhì)粒，濃度調(diào)至1 μg·μL-1，用于后續(xù)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

1.2 小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備和基因轉(zhuǎn)化

選取健康飽滿(mǎn)的蘇麥3號(hào)種子置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)。將出芽后的種子移至營(yíng)養(yǎng)土，并置于人工氣候箱中，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下生長(zhǎng)，待幼苗長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)改為24 h黑暗條件誘導(dǎo)黃化苗。當(dāng)黃化苗第二片真葉長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，取第二片真葉參照杜曉敏等[11]方法進(jìn)行葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備和PEG-Ca2+介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)懸浮至1 mL的WI溶液（0.7 mol·L-1甘露醇，4 mmol·L-1 MES，20 mmol·L-1 KCl）中，于室溫、黑暗條件下靜置保存。

1.3 熒光觀(guān)察

轉(zhuǎn)化后24 h，吸取原生質(zhì)細(xì)胞置于血球計(jì)數(shù)板上，在正置熒光顯微鏡（DM5000，Leica）下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)GFP或DsRED熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

成熟ATG8的C末端必須是甘氨酸殘基，并通過(guò)該殘基與PE連接后定位至自噬膜上。對(duì)于剛翻譯完成的ATG8，其C端甘氨酸外側(cè)的多余殘基會(huì)由ATG4加工切除。因此，構(gòu)建ATG8的融合基因表達(dá)載體時(shí)，一般將ATG8序列融合于熒光蛋白基因的下游。使用常規(guī)的酶切、連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建GFP-TaATG8h融合基因的表達(dá)載體pGFP-A8h。

候選重組質(zhì)粒經(jīng)插入位點(diǎn)兩側(cè)的XbaⅠ/SacⅠ雙酶切能夠正確切出368 bp 的TaATG8h基因片段（圖1A），結(jié)合DNA測(cè)序結(jié)果，表明GFP-TaATG8h融合基因表達(dá)載體（pGFP-A8h）構(gòu)建正確；圖1A上方顯示了該載體上GFP-TaATG8h融合基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)，融合基因的表達(dá)由兩個(gè)串聯(lián)的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

DsRED-TaATG8h融合基因表達(dá)載體pRED-A8h的構(gòu)建是以構(gòu)建好的pGFP-A8h為基礎(chǔ)，使用XhoⅠ/XbaⅠ切點(diǎn)將載體上的GFP基因替換為DsRED基因。候選重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切能夠正確切出694 bp的DsRED基因片段（圖1B），結(jié)合DNA測(cè)序結(jié)果，表明pRED-A8h載體的構(gòu)建正確；圖1B上方顯示了該載體上DsRED-TaATG8h融合基因表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)，融合基因的表達(dá)同樣由兩個(gè)串聯(lián)的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

2.2 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因的小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和表達(dá)

使用PEG-Ca2+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的兩個(gè)融合基因表達(dá)載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化后24 h的熒光觀(guān)察結(jié)果顯示，兩個(gè)融合基因GFP-TaATG8h和DsRed-TaATG8h均能夠在原生質(zhì)體中正確表達(dá)，GFP-TaATG8h融合蛋白在細(xì)胞中發(fā)出綠色的熒光（圖2A），DsRed-TaATG8h融合蛋白在細(xì)胞中發(fā)出紅色的熒光（圖2B）；兩個(gè)融合基因的轉(zhuǎn)化效率均超過(guò)50%。

3 結(jié)論與討論

自噬與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和逆境響應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)[12-14]。細(xì)胞內(nèi)自噬水平監(jiān)測(cè)方法的建立是深入揭示自噬調(diào)控機(jī)制和生理功能的重要基礎(chǔ)。ATG8蛋白定位于自噬小體膜上，因而是自噬小體的重要標(biāo)志分子。應(yīng)用上通常使用轉(zhuǎn)化方法在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)熒光蛋白標(biāo)記的ATG8，進(jìn)而通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀熒光的觀(guān)察和統(tǒng)計(jì)來(lái)反映自噬小體的積累和自噬發(fā)生的程度[7]。植物上，此類(lèi)自噬監(jiān)測(cè)方法已經(jīng)在擬南芥和水稻等模式物種上得到應(yīng)用[8-9]，但在重要農(nóng)作物小麥上還未見(jiàn)報(bào)道，限制了對(duì)小麥自噬功能的深入研究。建立靶向ATG8的自噬監(jiān)測(cè)方法的前提是構(gòu)建熒光蛋白基因-ATG8融合基因表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)和熒光激發(fā)。本研究選擇小麥ATG8家族的TaATG8h基因，構(gòu)建了該基因融合于GFP/DsRED下游的融合基因表達(dá)載體，載體構(gòu)建的正確性得到酶切和測(cè)序結(jié)果的確認(rèn)；以易于進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體為受體，通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)融合基因在原生質(zhì)體細(xì)胞中的高效表達(dá)，在表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞中觀(guān)察到了清晰的熒光。本研究結(jié)果為在小麥上建立以ATG8為靶標(biāo)的自噬水平監(jiān)測(cè)技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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