陳麗莉，韓晨珠，王艷心，王 成，李保強(qiáng)△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000；2.漯河市第二人民醫(yī)院皮膚科）

結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nodosum，EN)是一種常見的炎癥性脂膜炎，以紅斑、炎癥性皮下結(jié)節(jié)為主要表現(xiàn)，該病病因復(fù)雜，確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，病理變化主要以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主。目前國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群分布異常與EN發(fā)病有關(guān)，而CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能失衡是T淋巴細(xì)胞免疫功能異常的重要表現(xiàn)[1-3]。本研究擬檢測(cè)EN患者皮損處CD4、CD8表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討EN的發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科1984年9月-2014年6月經(jīng)臨床及病理確診，并存檔的原發(fā)性EN患者皮損組織和正常皮膚組織蠟塊。疾病組49例患者中男4例、女45例，年齡6歲～60歲，平均（37.18±12.26）歲；正常組中10例正常皮膚組織，男3例、女7例，年齡20歲～65歲，平均（43.00±14.51）歲。

1.2 試劑來源 兔抗人CD4單克隆抗體（RMA-0620）、鼠抗人CD8單克隆抗體（MAB-0021）、即用型快捷型免疫組化MaxVisionTM試劑盒、羊抗鼠/兔（KIT-5010）二抗、DAB顯色試劑盒（DAB-0031），福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定

1.3.1 染色方法：采用MaxVisionTM免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CD4和CD8的表達(dá)。組織置于4%甲醛中固定后常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4μm；切片于80℃電熱恒溫箱烘烤3h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%H2O2室溫孵育，抗原修復(fù)，一抗（工作濃度1：50）4℃過夜，二抗室溫孵育2小時(shí)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)后封片。光鏡下觀片，雙盲法計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。CD4和CD8陽性著色為棕黃色顆粒，位于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，以已知陽性結(jié)果的組織切片作為陽性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判斷：根據(jù)Fromowitz[4]的綜合計(jì)分法進(jìn)行。在高倍鏡下（10×40）作如下評(píng)分：⑴陽性程度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；⑵陽性細(xì)胞百分率：5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分。⑴+⑵判定最終結(jié)果：＜2分為陰性（-），2分～3分為弱陽性（+），4分～5分為中度陽性（++），6分～7分為強(qiáng)陽性（+++），以+及以上計(jì)為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，率的比較用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

疾病組CD4陽性率為100.00%，明顯高于對(duì)照組的70.00%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。疾病組、對(duì)照組CD8陽性率分別為93.88%和90.00%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1-4，附表：

附表 疾病組皮損處和正常組皮膚組織CD4和CD8的表達(dá)情況

圖1 EN皮損組織CD4染色（×400）

圖2 正常皮膚組織CD4染色（×400）

圖3 EN皮損組織CD8染色（×400）

圖4 正常皮膚組織CD8染色（×400）

3 討論

根據(jù)細(xì)胞表面白細(xì)胞分化抗原決定簇的表達(dá)情況可將T細(xì)胞分為兩個(gè)亞群，即表達(dá)CD4的輔助T細(xì)胞(Th)和表達(dá)CD8的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，二者通常被作為判斷和確定T淋巴細(xì)胞亞群及成熟的標(biāo)志。CD4分子為單鏈跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族(IgSF)成員，主要分布于T淋巴細(xì)胞，也分布于單核-巨噬細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、B細(xì)胞的表面；CD8分子為二聚體結(jié)構(gòu)，其雙鏈結(jié)構(gòu)也屬于IgSF成員[3]。CD4+T細(xì)胞識(shí)別由MHC-Ⅱ類分子提呈的外源性抗原肽，作用是通過激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞因子，引起以T淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的局部滲出性炎癥和免疫反應(yīng)[5]。在炎癥反應(yīng)中，活化的CD4+T細(xì)胞通過過度表達(dá)共刺激分子（CD40L）與單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、抗體形成及免疫球蛋白的分泌。CD8+T細(xì)胞通過識(shí)別由MH C-Ⅰ類分子提呈的內(nèi)源性抗原肽發(fā)揮效應(yīng)，主要是在某些細(xì)胞因子誘導(dǎo)下識(shí)別靶細(xì)胞，進(jìn)而殺傷靶細(xì)胞，誘發(fā)免疫損傷，同時(shí)抑制體液免疫[6-7]。正常情況下，CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量或比值維持動(dòng)態(tài)平衡，以保持機(jī)體正常的生理功能[3]。

有研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群分布異常與多種血管炎性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而CD4+T細(xì)胞數(shù)量及功能失衡是導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞免疫功能異常的重要因素[3]。EN做為一種以脂肪小葉間隔為主的脂膜炎，主要由Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)介導(dǎo)，55%以上為原發(fā)性，但也可以是系統(tǒng)疾病的皮膚表現(xiàn)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、麻風(fēng)、炎性腸病、結(jié)節(jié)病及腫瘤等[8]。Behcet’s病是一種自身免疫性疾病，可累及多個(gè)系統(tǒng)，而結(jié)節(jié)性紅斑也是此病的常見體征。Wang等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，Behcet’s病患者結(jié)節(jié)性紅斑皮損處有大量的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)為主；并且發(fā)現(xiàn)，Behcet’s病結(jié)節(jié)性紅斑中共刺激分子的大量表達(dá)促進(jìn)了CD4+T細(xì)胞的活化、增生，從而導(dǎo)致了炎癥的發(fā)生和持續(xù)。本研究所有病例的結(jié)節(jié)性紅斑均為原發(fā)表現(xiàn)，且結(jié)果與上述研究發(fā)現(xiàn)類似，EN皮損處和正常皮膚組織均可見CD4和CD8的陽性表達(dá)，但疾病組CD4陽性表達(dá)率明顯高于正常組，說明EN皮損處也存在著以CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的免疫損傷；但疾病組和正常對(duì)照組CD8陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮EN皮損的免疫損傷不以CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主。

綜上所述，本研究顯示在EN患者皮損處存在著T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，主要是與CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷有關(guān)，因此考慮CD4+T細(xì)胞在EN皮損的發(fā)病過程中起了重要作用。

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