李瑞陽，王云之，葛蕊，石文昊，丁琛,

1 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200438

2 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·北京 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

肝臟是由許多高度特化的細(xì)胞組成的代謝器官。肝細(xì)胞包括肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞 (肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞、kupffer細(xì)胞)。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞承擔(dān)大量的代謝、調(diào)節(jié)和毒理功能[1]，因此肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的體外肝臟模型對(duì)于藥物研發(fā)至關(guān)重要[2-3]。但是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生去分化，代謝解毒功能逐漸喪失，這為其廣泛應(yīng)用帶來極大的不便[4]。研究人員試圖通過改善培養(yǎng)條件從而達(dá)到維持體外肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞功能的目的。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)可以模仿體內(nèi)微環(huán)境，在體外建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，這對(duì)于研究細(xì)胞之間相互作用、改善單層細(xì)胞培養(yǎng)等方面具有重要意義[5]。目前與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞多是細(xì)胞系，有結(jié)果顯示大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與小鼠 NIH3T3共培養(yǎng)促進(jìn)白蛋白分泌，提升氨消除速率和CYP1A1活性[6-7]。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞可能延緩去分化過程，保持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型[8]。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)于模擬肝的體內(nèi)環(huán)境、維持肝的功能及細(xì)胞間的相互作用優(yōu)勢(shì)明顯。為了充分發(fā)揮共培養(yǎng)作為器官模型的優(yōu)勢(shì)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與來自相同器官的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)是最好的選擇。Bale等分離出肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和富集非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并在 transwell中按一定的比例混合共培養(yǎng)，觀察每種細(xì)胞在共培養(yǎng)過程中的變化，通過脂多糖 (Lipopolysacchride，LPS) 刺激捕獲肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用[9]。

近年來蛋白質(zhì)組學(xué)在細(xì)胞分辨率水平揭示細(xì)胞特異功能的優(yōu)勢(shì)越來越明顯。為了了解去分化機(jī)制，研究人員從培養(yǎng)了1、3、7 d肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及Hepa 1–6細(xì)胞系中提取蛋白，質(zhì)譜檢測(cè)并獲得細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜[10]。通過定量分析蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在1周的測(cè)量時(shí)間內(nèi)肝原代細(xì)胞逐漸趨向于典型的細(xì)胞系。新鮮分離與培養(yǎng)的原代細(xì)胞和Hepa 1–6細(xì)胞系之間的蛋白質(zhì)組相關(guān)性顯示蛋白水平相似性逐漸降低。另外研究人員利用組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)4種肝細(xì)胞在代謝、凝血和補(bǔ)體途徑中具有明顯分工。從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度提出實(shí)質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成通路的下游組件、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)通路的概念[11]。4種肝細(xì)胞之間的協(xié)同作用解釋了肝臟如何有效地執(zhí)行受精確控制的功能。

TF是一類直接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白[12]。這些特殊的反式作用蛋白與順式調(diào)控 DNA序列相互作用，位于基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或沉默子區(qū)域內(nèi)，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[13]。它們通過促進(jìn)或阻礙RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合DNA，并通過與多種共活化因子或輔助抑制因子、染色質(zhì)重塑因子和組蛋白修飾酶相互作用而發(fā)揮作用。除了作為一般轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組分的 TFs，組織特異性轉(zhuǎn)錄因子例如肝臟富集轉(zhuǎn)錄因子 (Liver enriched transcription factor，LETF) 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，決定細(xì)胞命運(yùn)[14]。在肝臟中，LETF通過控制整個(gè)肝細(xì)胞中廣泛基因的表達(dá)發(fā)揮作用，包括編碼中間代謝、尿素循環(huán)以及血漿蛋白和凝血因子效應(yīng)物的基因[15-16]。另外整套和藥物代謝相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄也受到LETF的調(diào)控。原代肝細(xì)胞培養(yǎng)期間細(xì)胞特異性功能的喪失可以通過LETF的蛋白表達(dá)水平的下降表現(xiàn)出來。HNF-1α和 HNF-1β、HNF-4α、CEBPα和CEBPβ蛋白表達(dá)水平下降是原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異功能消失的重要指標(biāo)[17-18]。

如今人們開始利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中蛋白的變化，試圖描繪去分化過程中蛋白質(zhì)尤其TFs的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而了解肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化過程的分子機(jī)制。但是 TFs在細(xì)胞內(nèi)屬于低豐度蛋白，利用質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定TFs比較困難。本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)了一種富集鑒定內(nèi)源性 TFs的方法，該方法設(shè)計(jì)出串聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)元件 (Transcription factor response elements，TFREs)作為親和試劑富集TFs，然后利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定分析內(nèi)源性TFs[19]。但是這種方法不能滿足快速鑒定微量樣品內(nèi)源性 TFs的需求。因此我們?cè)诖朔椒ɑA(chǔ)上，開發(fā)出具有高靈敏度、高效率、高通量的新型富集內(nèi)源性 TFs的方法，即TOT方法[20]。結(jié)合此技術(shù)，本文開發(fā)出肝細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜分析系統(tǒng)，為以后研究細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中TFs的變化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

6–8周雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠 (斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，蠕動(dòng)泵 (保定蘭格公司，BT100-1F)，輸液器 (山東安得新華醫(yī)療公司，TPE型)，移液槍頭 (Axygen，TR-222-C)，C18 固相萃取膜 (3M，329574)，M280磁珠 (Invitrogen，00324960)。

1.2 方法

1.2.1 灌流與細(xì)胞培養(yǎng)

利用兩步法進(jìn)行小鼠肝門靜脈灌流[21]，首先灌流去血3–4 min，然后開始用酶液灌流消化，直至肝臟沒有彈性，顏色發(fā)白。剪下肝臟后，細(xì)胞經(jīng)過150目篩子過濾，通過 50×g離心分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞沉淀，剩余非實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過密度梯度離心分離獲得，最后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞以1∶4比例進(jìn)行混合，接種到6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，單獨(dú)培養(yǎng)只含有肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖 (HSC代表星形細(xì)胞；LSEC代表肝竇內(nèi)皮細(xì)胞；KC代表kupffer細(xì)胞；HC代表肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；NPC代表肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞；LC-MS代表液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))Fig.1 Experimental workflow.HSC stands for hepatic stellate cell; LSEC stands for liver sinusoidal endothelial cell;KC stands for kupffer cell; HC stands for hepatocyte; NPC stands for non-parenchymal cell; LC-MS stands for liquid chromatograph-mass spectrometer.

1.2.2 收集細(xì)胞與提取NE

細(xì)胞在培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)只收獲肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。胰蛋白酶消化細(xì)胞，50×g、4 ℃離心3 min，重復(fù)3次，保留肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞沉淀，去除共培養(yǎng)的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用低滲溶液重懸，冰置30 min，–80 ℃冷凍。冰上融化細(xì)胞后，于3 715×g、4 ℃離心 15 min，棄上清，依次加入低鹽、高鹽溶液，垂直混勻30 min。16 000×g、4 ℃離心 10 min，棄沉淀。

1.2.3 TOT

0.1 μg TFRE和2 μL M280磁珠垂直混勻孵育30 min，之后加入到TOT槍頭底部，將5 μg NE轉(zhuǎn)移到TOT槍頭中，混勻，NE中TFs與TFRE通過離心結(jié)合。用NETN、PBS、NH4HCO3去除非特異性蛋白。將0.1 μg的胰蛋白酶加入到槍頭中，用胰蛋白酶酶解富集到的TFs蛋白，于37 ℃酶解1 h。乙腈洗脫酶解后肽段，抽干樣品，流程見圖2。

圖2 TOT實(shí)驗(yàn)圖Fig.2 TOT experiment.

1.2.4 鑒定TFs

干燥后的肽段重新溶解到0.1%甲酸溶液中，溶解后樣品在 Easy-nLC 1000 nano-HPLC系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific) 和Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific) 上進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測(cè)。利用 MaxQuant對(duì)蛋白進(jìn)行定量，蛋白和肽段水平錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (False discover rate，F(xiàn)DR) 小于0.01。利用Excel和R語言進(jìn)行生物學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

小鼠經(jīng)過灌流獲取的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有6×107個(gè)，密度梯度離心獲得非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)為 1.5×107個(gè)。細(xì)胞經(jīng)過臺(tái)盼藍(lán)染色，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)可知肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的活性達(dá)到80%以上，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的活性達(dá)到90%以上。

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)：從圖3可以看出，培養(yǎng)6 h后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出角邊緣，細(xì)胞貼壁很好并有伸展的趨勢(shì)。培養(yǎng)24 h，細(xì)胞之間的空間變小，細(xì)胞接觸增多。培養(yǎng)48 h，細(xì)胞扁平化更加明顯，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞多個(gè)細(xì)胞核聚集在一起，細(xì)胞之間的界限變得模糊。培養(yǎng)72 h，細(xì)胞已經(jīng)分離并且在一些區(qū)域中可見凝聚的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞間空間變大與細(xì)胞接觸變少。

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)：共培養(yǎng)6 h后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也呈現(xiàn)出角邊緣；非實(shí)質(zhì)細(xì)胞由于體積小，還沒有呈現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)。共培養(yǎng)24 h，實(shí)質(zhì)細(xì)胞開始伸展，但伸展性弱于單獨(dú)培養(yǎng)，且細(xì)胞死亡率增高。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞伸展比較明顯，可以看到肝竇內(nèi)皮細(xì)胞占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的比重較大，實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的相互作用主要以實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞相互作用為主。共培養(yǎng)48 h，細(xì)胞扁平化明顯，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞核聚集狀態(tài)，細(xì)胞之間的界限變得模糊。細(xì)胞活力相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)更好，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞更加伸展，和實(shí)質(zhì)細(xì)胞接觸增多。共培養(yǎng) 72 h，可見凝聚的凋亡細(xì)胞，剩余的實(shí)質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)片狀偽足與遷移的特征。細(xì)胞存活率相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)較高。單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的細(xì)胞在體外進(jìn)行去分化，共培養(yǎng)時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生存率更高。

圖3 肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng) (紅色箭頭指向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；藍(lán)色箭頭指向非實(shí)質(zhì)細(xì)胞)Fig.3 Liver cell mo-culture and co-culture.Red arrows point to hepatocyte; blue arrows point to non-parenchymal cells.Scale bar=115.1 μm.

2.2 TFs富集及鑒定

利用 TOT方法對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi) TFs進(jìn)行富集，然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。3次試驗(yàn)總共富集鑒定到3 014個(gè)蛋白，其中在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都鑒定到1 542個(gè)。新鮮分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞鑒定到的蛋白數(shù)最少，為2 099個(gè)。而共培養(yǎng)72 h鑒定到蛋白數(shù)最多，為2 533個(gè)。3次試驗(yàn)總共鑒定到219個(gè)TFs，其中在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都鑒定到114個(gè)。不管是單獨(dú)培養(yǎng)還是共培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，TFs數(shù)目是逐漸增加的，共培養(yǎng)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)鑒定到的 TFs數(shù)目都多于單獨(dú)培養(yǎng)，結(jié)果見圖4。

2.3 TFs在去分化過程中的變化

將鑒定到的TFs進(jìn)行熱圖聚類分析，和新鮮分離的肝細(xì)胞 (0 h) 相比，TFs在其他時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平均表現(xiàn)出明顯的差異。一些控制肝細(xì)胞主要代謝功能的TFs在0 h高表達(dá)的TFs隨著時(shí)間的推移表達(dá)水平變低，如 HNF-1α、HNF-4α、MLXIPL、PROX1等。而與細(xì)胞增殖相關(guān)的TFs，如HMGA2、SMARCC2、SOX4、RBPJ等表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，肝臟特異性功能的丟失體現(xiàn)在肝臟特異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)下調(diào)[9]。質(zhì)譜結(jié)果表明肝臟特異轉(zhuǎn)錄因子HNF-1α與 HNF-4α的蛋白水平表達(dá)分別下調(diào)為原來的7.4%和22.2%。另外肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中伴隨著免疫通路的激活，質(zhì)譜結(jié)果顯示 NF-κB1上調(diào)了13.9倍。TFs整體變化見圖5。

圖4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 (A：蛋白數(shù)目；B：TFs數(shù)目)Fig.4 Identification results by mass spectrum.(A) Number of protein.(B) Number of TFs.

圖5 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞TFs在不同條件下蛋白水平動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Transcriptional factors of hepatocytes change on protein level in different conditions.

圖6 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞TFs在不同條件下通路富集 (A：表達(dá)上調(diào)TFs的通路富集；B：表達(dá)下調(diào)TFs的通路富集.mo代表單獨(dú)培養(yǎng)；co代表共培養(yǎng))Fig.6 Pathway enrichment of hepatocyte TFs in different conditions.(A) Pathway enrichment of up-regulated TFs.(B)Pathway enrichment of down-regulated TFs.mo stands for mo-culture; co stands for co-culture.

相對(duì)于0 h，將TFs在其他時(shí)間點(diǎn)的蛋白水平上下調(diào)為原來的 25%以及顯著性水平 (Pvalue)0.05作為閾值，進(jìn)行TFs通路聚類分析。圖6A可知，24 h時(shí)，細(xì)胞周期、DNA復(fù)制以及免疫相關(guān)的通路在單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下都被激活；48 h時(shí)，細(xì)胞周期在兩種培養(yǎng)條件下都很活躍，共培養(yǎng)更顯著地富集到凋亡、免疫信號(hào)通路上；72 h時(shí)這些信號(hào)通路激活程度下降，只有細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、胞外基質(zhì)-受體相互作用依舊活躍?？傊?，體外培養(yǎng)顯著激活細(xì)胞周期、凋亡、免疫等通路。單獨(dú)和共培養(yǎng)過程中細(xì)胞周期和 DNA復(fù)制很活躍，說明肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外傾向于增殖。通過分析下調(diào)的TFs參與的通路可知，兩種培養(yǎng)條件都可以顯著抑制代謝相關(guān)通路，補(bǔ)體途徑、膽汁分泌與體外類固醇激素的合成都受到顯著抑制。單獨(dú)培養(yǎng)48 h和72 h，PPAR和藥物代謝相關(guān)的細(xì)胞色素 P450通路顯著被抑制，而這種情況只在共培養(yǎng)72 h時(shí)發(fā)生，說明共培養(yǎng)可能延遲了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞代謝失調(diào)的速度，維持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能 (圖6B)?？傊?，兩種培養(yǎng)條件下，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)通路被抑制，但共培養(yǎng)條件可能延緩這一情況的發(fā)生。

3 討論

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中會(huì)大量死亡，導(dǎo)致只能獲得少量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，TFs在細(xì)胞內(nèi)屬于低豐度蛋白，監(jiān)測(cè)TFs在細(xì)胞內(nèi)蛋白水平上的動(dòng)態(tài)變化變得非常困難。我們?cè)赥FRE方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)出可以富集微量樣品中TFs的TOT方法。這種方法允許提取培養(yǎng)在6孔板中細(xì)胞的TFs，解決樣品量少的問題，提高了實(shí)驗(yàn)通量。體外 TOT富集聯(lián)合質(zhì)譜鑒定能在很短時(shí)間內(nèi)獲取TFs表達(dá)譜。從樣品制備到數(shù)據(jù)采集整個(gè)過程可以在3 h內(nèi)完成，其中包含大約1 h的質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間。由于實(shí)驗(yàn)都是在TOT和離心機(jī)中進(jìn)行，所以可以一次處理多個(gè)樣品。TOT目前可以有效獲得內(nèi)源性TFs表達(dá)譜，相信以后隨著技術(shù)的改善，會(huì)有越來越多的TFs被鑒定到。同時(shí)我們構(gòu)建肝細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)，初步探究了非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中對(duì)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的作用，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在可以改善實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存活和形態(tài)。

對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞TFs進(jìn)行富集鑒定，發(fā)現(xiàn)0 h鑒定到的TFs相對(duì)于其他時(shí)間點(diǎn)偏少，原因可能是正常的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞存在較多的高豐度蛋白 (比如白蛋白)，導(dǎo)致一些低豐度的TFs檢測(cè)不到。另外相對(duì)于0 h，對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)多出的TFs進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些TFs顯著富集到MAPK、細(xì)胞周期、NF-κB通路上。另外共培養(yǎng)在24 h和48 h鑒定到的TFs多于單獨(dú)培養(yǎng)，至于確切原因還不清楚，需要進(jìn)一步探索。肝原代細(xì)胞體外培養(yǎng)會(huì)下調(diào)重要的LETF蛋白水平，例如HNF-1α和HNF-4α，其控制許多毒藥物動(dòng)力學(xué)過程和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特有的其他特征。HNF-4α是在肝臟里面表達(dá)很豐富的TF[22]，參與調(diào)控脂肪酸氧化、載脂蛋白代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝、血液凝結(jié)等[23]。HNF-4α可以結(jié)合到超過40%的活性肝臟基因啟動(dòng)子上[24]，其對(duì)肝功能相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)極其重要。本實(shí)驗(yàn)也鑒定到 HNF-1α和 HNF-4α的下調(diào)，說明肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能在體外培養(yǎng)過程中逐漸喪失。在小鼠灌流過程中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生氧化脅迫，激活NF-κB 通路[25-26]。本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子功能富集在NF-κB通路上，NF-κB1呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在小鼠灌流過程中，肝臟會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注 (Ischemia reperfusion，I/R) 損傷，TNF-α誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，NF-κB通路被激活，進(jìn)而增強(qiáng)NF-κB介導(dǎo)的BCL-2家族成員比如BAK、BAX和BAD的轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)過程中趨向凋亡。整體將差異顯著的TFs進(jìn)行功能聚類，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)可以延緩代謝的失調(diào)。我們也鑒定到另外一些和代謝、增殖相關(guān)的重要的轉(zhuǎn)錄因子，如HNF-1α、CEBPα、E2F3、RB1等。大規(guī)模監(jiān)測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)變化有助于進(jìn)一步了解肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外去分化過程。應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞存活通路的上調(diào)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷和功能丟失過程中起重要作用，比如MEK/ERK和NF-κB途徑對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表型起負(fù)調(diào)控作用。因此在培養(yǎng)過程中的所有階段，特別是在肝細(xì)胞分離過程中，減少細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可能是體外維持細(xì)胞活性和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表型的最可行的方法。本研究中得到的一些結(jié)果可能對(duì)于單層培養(yǎng)系統(tǒng)是特異的，但使用這樣簡(jiǎn)單的系統(tǒng)可以幫助我們鑒定已知的和未知的去分化機(jī)制，全面了解肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化過程。未來對(duì)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化的研究可以綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和其他組學(xué)方法，提供關(guān)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞全方位的了解，提供更客觀的分析結(jié)果。本研究比較了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)，開發(fā)出細(xì)胞培養(yǎng)-TFs快速鑒定模型。該模型可以有效獲得肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)TFs表達(dá)譜，并對(duì)其進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可以改善實(shí)質(zhì)細(xì)胞生存環(huán)境并延緩肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞代謝的下調(diào)。在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)上調(diào)的TFs和細(xì)胞增殖、免疫、死亡等過程相關(guān)，而下調(diào)的TFs則與代謝過程相關(guān)。未來這一模型可以為探究肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化機(jī)制提供更多的證據(jù)，共培養(yǎng)系統(tǒng)可以幫助我們了解各種細(xì)胞之間的相互作用。

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