陳磊，陳晟，吳敬，吳丹

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

β-淀粉酶 (β-amylase，EC 3.2.1.2)，又稱淀粉β-1,4-麥芽糖苷酶，是一種外切型淀粉酶，能夠從淀粉的非還原末端依次水解相隔的 α-1,4-葡萄糖苷鍵生成麥芽糖。在大麥、甘薯、玉米、小麥和大豆等高等植物中都有著較豐富的 β-淀粉酶，其在釀造行業(yè)及食品工業(yè)中有很大的應(yīng)用價(jià)值。例如，啤酒釀造行業(yè)利用麥芽中的 β-淀粉酶直接糖化，白酒工業(yè)中用作糖化劑；在食品工業(yè)中主要用于生產(chǎn)高麥芽糖漿、麥芽糖醇和飴糖等。自 1974年Higashihara等[1]首次發(fā)現(xiàn)了巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium胞外含有β-淀粉酶以來，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他幾種能產(chǎn)生該酶的微生物，包括蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus[2-3]、環(huán)狀芽孢桿菌Bacillus circulans[4]、多粘芽孢桿菌Bacillus polymyxa[5]、熱厭氧桿菌屬Thermoanaerobacterium和高溫放線菌Thermeoactinomycessp.[6]等。

由于植物來源的β-淀粉酶提取、純化過程較為復(fù)雜，成本較貴，相比而言微生物來源的β-淀粉酶具有生產(chǎn)操作簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。但是現(xiàn)已報(bào)道的微生物來源的β-淀粉酶大多耐熱性差，且比酶活不高，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。因此篩選出高熱穩(wěn)定性的微生物β-淀粉酶對其在淀粉糖工業(yè)中的應(yīng)用有著十分重要的意義。

易錯(cuò)PCR屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，不需要事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制、保守序列等因素，而是通過模擬自然進(jìn)化機(jī)制來為酶基因創(chuàng)造體外進(jìn)化的條件，進(jìn)而對目的蛋白進(jìn)行分子改造，并定向篩選研究進(jìn)化酶的酶學(xué)性質(zhì)。易錯(cuò)PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的定向進(jìn)化方法之一，具有操作方便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。

目前國內(nèi)外多數(shù)專家學(xué)者使用體外分子進(jìn)化技術(shù)研究了多種酶制劑[7]，諸如脂肪酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，其酶學(xué)性質(zhì)都得到了一定的改善。對于微生物來源β-淀粉酶的研究，目前主要是圍繞不同宿主的克隆表達(dá)、酶學(xué)定性[8]，而針對其酶學(xué)性質(zhì)的分子改造顯得較少，在定向進(jìn)化提高其熱穩(wěn)定性方面，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。β-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于淀粉糖、食品及醫(yī)藥等生產(chǎn)領(lǐng)域。例如，與麥芽糖淀粉酶、普魯蘭酶等復(fù)配制備超高純度麥芽糖漿，生產(chǎn)高附加值的海藻糖、麥芽酮糖等。然而其熱穩(wěn)定性差，不利于酶的復(fù)配轉(zhuǎn)化，具有容易染菌、反應(yīng)液粘度高等缺點(diǎn)。本研究通過易錯(cuò)PCR技術(shù)對比酶活較高的彎曲芽孢桿菌來源的β-淀粉酶進(jìn)行體外分子定向進(jìn)化，通過LB瓊脂淀粉板初篩、96孔板DNS法測酶活等方法，高通量篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

Escherichia coliJM109、E.coliBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pET-24a(+) 和pMD18-T 購于大連寶生物公司。野生型 β-淀粉酶基因來源Bacillus flexusCCTCC 2015368 (bfa)，現(xiàn)已保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉 5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方上，添加1.0%–2.0% (W/V)的瓊脂。

TB培養(yǎng)基：酵母粉24.0 g/L，甘油5.0 g/L，胰蛋白胨 12.0 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，KH2PO42.31 g/L。

SOB培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，MgCl20.952 g/L，NaCl 0.5 g/L，KCl 0.186 g/L。

LB瓊脂淀粉板：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加可溶性淀粉1 g/L，用于突變體的初步篩選。

1.1.3 試劑

rTaq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Primer StarTMHS DNA聚合酶、DL-2000和DL-10000 DNA Marker均購于TaKaRa有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR純化試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司；中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司 (上海)；卡那霉素 (Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)均購自上海生工生物工程有限公司；分子級的胰蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司；所有質(zhì)粒測序均由上海睿迪生物技術(shù)有限公司提供支持；無特殊說明，其他試劑均屬于國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 突變體文庫的構(gòu)建和易錯(cuò)PCR技術(shù)

來源于Bacillus flexusCCTCC 2015368 (bfa)的β-淀粉酶基因用作構(gòu)建突變體文庫的模板，并設(shè)計(jì)上游引物ATTATT、CGTATACGTTG-3′)，并分別引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn) (下劃線部分)。最適反應(yīng)緩沖體系 (50 μL) 為：2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L MnCl2，0.2 mmol/L dNTPs，DNA模板為50 ng，5 μL 10×緩沖液Mg2+(-) 和rTaqDNA聚合酶為5 U，再加入ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，并于4 ℃下保溫。

將PCR產(chǎn)物用1% (W/V) 的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，用PCR純化試劑盒進(jìn)行膠回收。純化后的bfa基因和載體 pMD-18T連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。用NcoⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒bfa-pMD-18T，獲得易錯(cuò)bfa基因，然后連接到載體 pET24a(+)，得到的質(zhì)粒命名為pET-bfa。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 表達(dá)宿主中，涂布于LB抗性平板 (Kan，30 μg/mL)，構(gòu)建突變體文庫。

1.2.2 突變體文庫的篩選

使用高通量篩選平臺(tái) (Molecular Devices，Qpix 2) 從LB抗性平板 (Kan) 上挑選易錯(cuò)突變體BFA，將單克隆一一對應(yīng)地接種到含有 600 μL新鮮LB培養(yǎng)基 (Kan，30 μg/mL) 的96深孔板中。重組菌在37 ℃、900 r/min下恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)8–10 h，相同條件下轉(zhuǎn)接50 μL種子培養(yǎng)基到含有600 μL新鮮TB培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)2 h，然后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組酶[9]。重組菌在25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)48 h后，將發(fā)酵液在4 000 r/min、4 ℃下離心20 min，取上清200 μL于96淺孔板中，這些96淺孔板中的酶液將用于初篩的酶活分析。本研究設(shè)計(jì)了一個(gè)LB瓊脂淀粉板用于突變體BFA的初篩分析，通過使用高通量篩選系統(tǒng)的gridding程序，將突變體BFA的發(fā)酵上清一一轉(zhuǎn)接到瓊脂淀粉板并于 37 ℃下過夜培養(yǎng)。隨后用碘液0.03% (W/V) 涂布瓊脂淀粉板，發(fā)現(xiàn)有 β-淀粉酶活力的地方會(huì)產(chǎn)生透明圈，初篩的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)透明圈的大小來判斷的。選擇突變體BFA酶活高于或等于野生型的，然后接種于96深孔板進(jìn)一步篩選。最后通過96-孔板DNS法定量測定突變體BFA的酶活，選擇出酶活大于或者等于野生型的突變體用于復(fù)篩分析。

1.2.3 野生型和突變體 β-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

將帶有重組質(zhì)粒pET-bfa的大腸桿菌在37 ℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng) LB種子 (Kan，30 μg/mL) 8–10 h，然后吸取種子培養(yǎng)基2.5 mL接種到50 mL的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中。在37 ℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)2 h后加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG，最后轉(zhuǎn)移搖瓶至25 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h[10]。發(fā)酵液于8 000 r/min、4 ℃下離心20 min收集上清液。向上清液中加入研磨之后的硫酸銨至終濃度為45% (W/V)，混合物于4 ℃下過夜培養(yǎng)并用磁力攪拌器不斷攪拌，確保沉淀完全。然后將混合物在4 ℃、8 000 r/min離心20 min收集沉淀，并用20 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.5) 懸浮，過夜透析。樣品加載到用20 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液平衡的SuperdexTM200 10/300 GL凝膠柱上，在0.5 mL/min的流速下使用上述緩沖液進(jìn)行洗脫、收集純化樣品。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，12%聚丙烯酰胺) 檢測目的蛋白的純度和分子量[11]。

1.2.4 酶活力的測定

β-淀粉酶活力分析是通過測定水解淀粉所釋放的還原糖的量。反應(yīng)體系的混合物包括：0.5 mL 2%(W/V) 的可溶性淀粉，0.4 mL 50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 7.0)，并將酶液稀釋成適宜的濃度添加至最后體積為1 mL。在55 ℃下反應(yīng)10 min之后，向1 mL的混合體系加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 終止反應(yīng)?；旌衔镌诜兴兄蠓? min發(fā)生顯色后立即于冰浴上冷卻，然后補(bǔ)加去離子水至最后體積為 12 mL，最后在540 nm下檢測上述溶液的吸光值；并以相同條件下緩沖液的測定作為空白對照。

上述條件下，每分鐘生成1 μmol/L麥芽糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位 (U)。

1.2.5 野生型和突變體β-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在55 ℃、pH 7.0的條件下以不同濃度的可溶性淀粉作為底物 (1–30 mg/mL)，通過上述DNS法測定純化后的野生型和突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。使用 GraphPad Prism 6.0軟件將獲得的數(shù)據(jù)擬合到Michaelis-Menten方程，得出Km和kcat值。計(jì)算野生型和突變體的kcat/Km，并比較結(jié)果。

1.2.6 野生型和突變體 β-淀粉酶最適溫度及熱穩(wěn)定性的分析

純化后的酶液分別在不同的溫度范圍內(nèi)(30–70 ℃) 測定β-淀粉酶活力，以最高的酶活力為 100%，從而確定出野生型和突變體 β-淀粉酶的最適溫度。

在 55 ℃下將純化后的 β-淀粉酶保溫在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 7.0) 中，于不同的時(shí)間范圍內(nèi) (10–70 min) 分別取出樣品并冰浴10 min，同時(shí)在不同溫度下保溫10 min，測定酶活力喪失50%時(shí)的溫度，即酶的半失活溫度T50。按照上述的DNS法測定殘留酶活，并以未處理的酶活為100%，用作測定野生型和突變體β-淀粉酶的半衰期。

1.2.7 野生型和突變體β-淀粉酶的最適pH分析

在pH 4.0–9.0的檸檬酸緩沖液中分別將兩種酶稀釋一定倍數(shù)，以上述分析的最適溫度為條件測定β-淀粉酶酶活力，以最高的酶活力為100%，從而確定出野生型和突變體β-淀粉酶的最適pH。

1.2.8 野生型和突變體的三維結(jié)構(gòu)分析

使用 SWISS-MODEL數(shù)據(jù) (http://www.expasy.org/swissmod/) 生成野生型和突變體BFA的三維結(jié)構(gòu)模型，并且以同源性最高的蠟狀芽孢桿菌β-淀粉酶 (1j10.1.A，PDB) 為模板[12-13]。借助 PyMol(http://www.pymol.org) 軟件分析所有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型和圖形特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體文庫的篩選

重組菌E.coliBL21 (DE3)/ pET-bfa在大腸桿菌中表達(dá)、發(fā)酵，對野生型β-淀粉酶進(jìn)行初始酶學(xué)性質(zhì)研究。然后，以重組質(zhì)粒為模板，通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行易錯(cuò)PCR方法的高通量篩選，表達(dá)宿主為操作簡單、方便的大腸桿菌。大約有6 000個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體文庫被用來篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體 β-淀粉酶，陽性突變率估算為60%。β-淀粉酶水解活力的大小可以用透明圈定性分析，采用瓊脂淀粉板顯色初篩得到一部分透明圈比對照大的突變體[14]。

進(jìn)一步將這些突變體于55 ℃保溫40 min，并在 96-孔板和具塞試管中分別測定殘留酶活。通過大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析得出，初篩有時(shí)候獲得透明圈比較大的突變體，經(jīng)過復(fù)篩測酶活發(fā)現(xiàn)并不是很高甚至和對照差不多；但是，復(fù)篩得出熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體，后續(xù)搖瓶驗(yàn)證也會(huì)相應(yīng)提高。經(jīng)過一系列的初步研究驗(yàn)證，與野生型β-淀粉酶相比，有一株突變體的熱穩(wěn)定性顯著提高。接下來把該突變體的質(zhì)粒抽提出來送測序，測序結(jié)果分析出突變體BFA只發(fā)生了一個(gè)氨基酸的替換，將 476位天冬氨酸突變成了天冬酰胺(Asp476Asn)[15]。

2.2 野生型和突變體 β-淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

重組β-淀粉酶用0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)于宿主E.coliBL21(DE3) 中，搖瓶發(fā)酵48 h之后收集酶液。為了進(jìn)一步研究野生型和熱穩(wěn)定性提高突變體 β-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)，首先對重組酶進(jìn)行(NH4)2SO4沉淀，透析脫鹽初步純化酶蛋白，然后通過檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (20 mmol/L，pH 6.5)平衡的SuperdexTM200 10/300 GL凝膠柱濃縮、純化 (表1和圖1)，并使用Bradford法以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白濃度[16]。從表2可知，突變體D476N的比活力為2 512 U/mg，比野生酶降低了18.76%。

2.3 野生型和突變體D476N的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 野生型和突變體β-淀粉酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在 55 ℃下，使用不同濃度的可溶性淀粉為底物 (1–30 mg/mL)，分別測定野生型和突變體D476N的動(dòng)力學(xué)參數(shù) (表 2)。突變體 D476N的Km值為97.98 μmol/L，是野生型的1.14倍。突變體D476N的kcat值為2 273.12 s–1，比野生型下降了18.97%；突變體kcat/Km值減少為野生型的71.01%。

2.3.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

突變體 D476N和野生型 β-淀粉酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性見圖2和圖3。

從圖2可以得知，野生型和突變體D476N β-淀粉酶的最適溫度均為55 ℃；在30–55 ℃的溫度范圍內(nèi)，β-淀粉酶的相對活力沒有明顯變化；值得注意的是，當(dāng)溫度升高到 60 ℃和 65 ℃時(shí)，突變體D476N能夠保留最初酶活的75%和44%，而野生型僅保留其酶活的37%和23%。

表1 重組野生型和突變體β-淀粉酶的純化過程參數(shù)Table 1 Parameters of purification step of the recombinant wild type and mutant β-amylase

圖1 SDS-PAGE分析純化后的野生型和突變體D476N β-淀粉酶(M：中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：野生型；2：突變體D476N)Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified wild type and mutant D476N β-amylases.M: marker; 1: wild type;2: mutant D476N.

表2 野生酶和熱穩(wěn)定性提高突變體 D476N的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of wild type and mutant D476N enzymes

圖2 野生型和突變體D476N的最適溫度Fig.2 The optimum temperature of wild type and mutant D476N.

圖3 野生型和突變體D476N的熱穩(wěn)定性Fig.3 The temperature stability of wild type and mutant D476N.

不同溫度下保溫10 min，測定酶活力喪失50%時(shí)的溫度，即酶的半失活溫度T50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變體D476N的半失活溫度T50值為62 ℃，與野生型T50值58 ℃相比提高了4 ℃。在最適溫度55 ℃的條件下，通過測定不同時(shí)間點(diǎn)殘留酶活來確定突變體D476N的熱穩(wěn)定性[17-18]，并與野生型相比較(圖3)。從圖3可知，突變體D476N在55 ℃下的半衰期為35 min，而野生型的半衰期只有18 min。

2.3.3 最適pH

突變體D476N和野生型β-淀粉酶的最適pH見圖4。

由圖4可見，野生型的最適pH為7.0，突變體D476N的最適pH為6.5；在pH 5.5–8.0的范圍內(nèi)，β-淀粉酶的相對酶活力均能保持在70%以上。目前β-淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用主要是和其他酸性淀粉酶進(jìn)行復(fù)配使用，突變體D476N的最適pH比野生型降低了0.5個(gè)單位，提高了重組酶酸性耐受性，更加有利于酶的催化反應(yīng)[19]。

3 討論

圖4 野生型和突變體D476N的最適pHFig.4 The optimum pH of wild type and mutant D476N.

本研究基于易錯(cuò)PCR技術(shù)的定向進(jìn)化策略篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體BFA，經(jīng)過一系列的初篩、復(fù)篩最終獲得了一株熱穩(wěn)定性提高的突變體D476N。突變體E.coliBL21(DE3)/pET-D476N表達(dá)在宿主E.coliBL21(DE3) 中，經(jīng)過硫酸銨沉淀、濃縮、純化[20]突變體重組β-淀粉酶；酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定發(fā)現(xiàn)，突變體 D476N與野生型相比對底物的親和性無明顯變化，而對可溶性淀粉的催化活性有少許降低。突變體 D476N在高溫條件下能夠保留較高的酶活，表明突變體 D476N的耐熱性比野生型有明顯提高[21-22]。

為了闡明突變體 D476N熱穩(wěn)定性提高的機(jī)理，對野生型和突變體D476N使用SWISSMODEL程序同源建模。以同源性最高的蠟狀芽孢桿菌晶體結(jié)構(gòu)為模板 (1j10.1A，PDB) 模擬得到野生型和突變體D476N的三維結(jié)構(gòu)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)表面的 loop區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性有重要作用，如淀粉液化芽胞桿菌來源的突變體葡聚糖酶[23]，通過定向進(jìn)化-易錯(cuò) PCR篩選得到熱穩(wěn)定性顯著提高的突變株，其共發(fā)生了7個(gè)氨基酸的取代，有5個(gè)位于蛋白質(zhì)的loop區(qū)域。使用PyMol軟件顯示出生成的突變體D476N的結(jié)構(gòu)模型和突變點(diǎn)的位置，發(fā)現(xiàn)突變后的氨基酸殘基 Asn476也位于蛋白質(zhì)的表面loop上 (圖5)。

圖5 熱穩(wěn)定性提高的突變體D476N β-淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)和突變氨基酸定位Fig.5 Three-dimensional structure of the mutant D476N β-amylase with increased thermostability and the location of mutated acid Asn476.The figure was made using PyMol.

MOE是一款基于分子動(dòng)力學(xué)模擬和蛋白設(shè)計(jì)的軟件，并能夠計(jì)算蛋白質(zhì)和小分子配體的能量，與小分子藥物設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域緊密相關(guān)。本研究中，首先利用MOE軟件將同源建模模擬得到的野生型和突變體D476N的三維PDB結(jié)構(gòu)能量最小化，然后分別計(jì)算出野生型和突變體D476N的分子自由能[24](ΔG)，軟件預(yù)測結(jié)果表明野生型β-淀粉酶和突變體 D476N 的分子自由能分別為118.20 kcal/mol和106.01 kcal/mol。根據(jù)蛋白質(zhì)分子自由能 (ΔG) 和熱穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可以得知，野生型β-淀粉酶將476位的天冬氨酸替代為天冬酰胺后，導(dǎo)致β-淀粉酶的分子自由能由118.20降低為106.01 kcal/mol，下降了10.3%。這一結(jié)果為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性提高提供了有力的依據(jù)，同時(shí)也表明了蛋白質(zhì)表面 loop區(qū)域的氨基酸突變對穩(wěn)定性的影響起到了顯著的作用。

[1]Rani RR, Jana SC, Nanda G.Saccharification of indigenous starches by β-amylase ofBacillus megaterium.World J Microbiol Biotechnol, 1994,10(6): 691–693.

[2]Nanmori T, Shinke R, Aoki K, et al.Purification and characterization of β-amylase fromBacillus cereusBQ10-S1 Spo II.Agric Biol Chem, 1983, 47(5):941–947.

[3]Yamaguchi T, Matsumoto Y, Shirakawa M, et al.Cloning, sequencing, and expression of a β-amylase gene fromBacillus cereusvar.mycoidesand characterization of its products.Biosci Biotechnol Biochem, 1996, 60(8): 1255–1259.

[4]Siggens KW.Molecular cloning and characterization of the beta-amylase gene fromBacillus circulans.Mol Microbiol, 1987, 1(3): 86–91.

[5]Murao S, Ohyama K, Arai M.β-amylases fromBacillus polymyxaNo.72.Agric Biol Chem, 1979,43(4): 719-726.

[6]Kitamoto N, Yamagata H, Kato T, et al.Cloning and sequencing of the gene encoding thermophilic β-amylase ofClostridium thermosulfurogenes.J Bacteriol, 1988, 170(12): 5848–5854.

[7]Saha BC, Zeikus JG.Microbial glucoamylases:biochemical and biotechnological features.Starch-St?rke, 1989, 41(2): 57–64.

[8]Higashihara M, Okada S.Studies on β-amylase ofBacillus megateriumstrain No.32.Agric Biol Chem, 1974, 38(5): 1023–1029.

[9]Zhou BY, Wang Z, Kong DY, et al.Selection of high β-amylase producing strain and its fermentation conditions.Chin J Biotech, 1994, 10(3): 258–262(in Chinese).周蓓蕓, 王崢, 孔德育, 等.熱穩(wěn)定β-淀粉酶高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵條件研究.生物工程學(xué)報(bào), 1994,10(3): 258–262.

[10]Totsuka A, Fukazawa C.Expression and mutation of soybean β-amylase inEscherichia coli.Eur J Biochem, 1993, 214(3): 787–794.

[11]Sohn CB, Lee SM, Kim MH, et al.Purification and characterization of β-amylase fromBacillus polymyxaNo.26-1.J Food Sci, 1996, 61(1): 230–234.

[12]Nanmori T, Numata Y, Shinke R.Isolation and characterization of aBacillus cereusmutant strain hyperproductive of exo-β-amylase.Appl Environ Microbiol, 1987, 53(4): 768–771.

[13]Nanmori T, Shinke R, Aoki K, et al.β-amylase production by a rifampin-resistant, asporogenous mutant fromBacillus cereusBQ10-Sl.Agric Biol Chem, 1983, 47(3): 609–611.

[14]Wu J, Zhang SZ.Cloning, expression and the characterization of β-amylase from aBacillus megateriumWS06.Chin J Biotech, 2008, 24(10):1740–1746 (in Chinese).吳襟, 張樹政.巨大芽孢桿菌 β-淀粉酶基因的克隆、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)分析.生物工程學(xué)報(bào), 2008,24(10): 1740–1746.

[15]Nanmori T, Nagai M, Shimizu Y, et al.Cloning of the β-amylase gene fromBacillus cereusand characteristics of the primary structure of the enzyme.Appl Environ Microbiol, 1993, 59(2): 623–627.

[16]Lee JS, Wittchen KD, Stahl C, et al.Cloning,expression, and carbon catabolite repression of thebamMgene encoding β-amylase ofBacillus megateriumDSM319.Appl Microbiol Biotechnol,2001, 56(1/2): 205–211.

[17]Wijma HJ, Floor RJ, Jekel PA, et al.Computationally designed libraries for rapid enzyme stabilization.Protein Eng Des Sel, 2014, 27(2): 49–58.

[18]Bankar SB, Jadhav SB, Singhal RS.Poly-ε-lysine amylase conjugates to increase the stability of enzyme.Food Biosci, 2014, 5: 85–90.

[19]Wang JL, Liu S, Du GC, et al.Construction and fermentation optimization of a recombinantBacillus subtilisproducing alkaline amylase.J Food Sci Biotechnol, 2016, 35(3): 296–302 (in Chinese).王靜麗, 劉松, 堵國成, 等.產(chǎn)堿性淀粉酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 35(3): 296–302.

[20]Ren HZ, Madison JT, Thompson JF.Identification of an ethanol-soluble protein as β-amylase and its purification from soybean seeds.Phytochemistry,1993, 33(3): 535–539.

[21]Liu YH, Fan S, Liu XG, et al.A highly active alpha amylase fromBacillus licheniformis: directed evolution,enzyme characterization and structural analysis.J Microbiol Biotechnol, 2014, 24(7): 898–904.

[22]Ben Mabrouk S, Zouari Ayadi D, Ben Hlima H, et al.Thermostability improvement of maltogenic amylase MAUS149 by error prone PCR.J Biotechnol, 2013, 168(4): 601–606.

[23]Qin JF, Gao WW, Li Q, et al.Improvement of thermostability of β-1,3-1,4-glucanase fromBacillus amyloliquefaciensBS5582 throughinvitroevolution.Chin J Biotech, 2010, 26(9): 1293–1301(in Chinese).秦久福, 高威威, 李崎, 等.通過體外分子進(jìn)化技術(shù)提高淀粉液化芽胞桿菌 BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性.生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(9): 1293–1301.

[24]Seeliger D, de Groot BL.Protein thermostability calculations using alchemical free energy simulations.Biophys J, 2010, 98(10): 2309–2316.