朱春權(quán)，朱曉芳，沈仁芳*

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硫化氫促進(jìn)缺磷條件下水稻根系細(xì)胞壁磷的再利用①

朱春權(quán)1,2，朱曉芳1，沈仁芳1*

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

在缺磷條件下，外源添加10 nmol/L H2S供體NaHS可以顯著提高水稻體內(nèi)的有效磷含量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S主要通過提高水稻根系細(xì)胞壁中的果膠含量和果膠甲酯酶的活性來增加水稻細(xì)胞壁磷的釋放，從而確保水稻在缺磷條件下的存活。添加H2S的清除劑亞牛磺酸后進(jìn)一步驗(yàn)證了H2S對水稻根系細(xì)胞壁磷再利用的調(diào)控作用。同時(shí)，測定3個(gè)負(fù)責(zé)水稻體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)，結(jié)果顯示H2S主要通過上調(diào)磷轉(zhuǎn)運(yùn)子6和8基因的表達(dá)來提高水稻體內(nèi)磷從根部往地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。

信號分子；H2S；細(xì)胞壁；果膠；果膠甲酯酶；磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因

磷是植物生長發(fā)育過程中的重要營養(yǎng)元素，它在植物中的含量約為0.5 ~ 5 g/kg干重。其中有機(jī)磷占植物體內(nèi)全磷含量的85%，無機(jī)磷占全磷含量的15%。磷是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、核酸以及能量物質(zhì)ATP等的重要組成成分[1]。并且，磷參與植物體內(nèi)的眾多生理生化反應(yīng)，比如光合作用、呼吸作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[2-3]。植物只有吸收充足的磷，才能正常生長發(fā)育，并且提高抵御外界脅迫如寒冷、干旱等的能力。

然而，世界上約有67% 的土壤處于缺磷狀態(tài)[4]，我國也約有2/3面積的耕地處于缺磷狀態(tài)[5]。雖然土壤中的總磷含量很高，但其中的可利用磷含量卻很少能超過10 μmol/L[6]，遠(yuǎn)低于植物植物體內(nèi)5 ~ 20 mmol/L的磷含量[3]。造成土壤缺磷的原因主要在于：在酸性的紅壤中，土壤中的磷易與Fe3+和Al3+等離子形成復(fù)合物，而在堿性的石灰質(zhì)土壤中，磷又易與Ca2+和Mn2+等離子形成難溶物；同時(shí)，在土壤中存在的微生物會將土壤中的磷轉(zhuǎn)化成有機(jī)態(tài)的磷，難以被植物最直接利用；而且土壤中的黏粒對磷也存在著強(qiáng)烈的吸附作用[1,3,7]。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，主要通過增加磷肥施用量或者改變磷肥施加方式來提高作物對磷肥的吸收[8-9]。在長期的進(jìn)化過程中，植物本身也形成了一系列應(yīng)對缺磷的措施。根系構(gòu)型的改變被認(rèn)為是植物主要的耐缺磷機(jī)制之一。在缺磷條件下，植物根冠比上升[10]，主根伸長受到抑制[11]，側(cè)根及根毛的長度和密度增加[12]，一些特殊的植物如白羽扇豆形成大量排根[13]，并且側(cè)根的空間位置改變，主要向含磷量較高的淺層地面生長[14]，從而增加植物對外界磷的吸收。并且，由于82% 的高等植物會和叢枝菌根等真菌進(jìn)行共生，因此在缺磷條件下，菌根真菌菌絲的伸長也是植物提高外界磷吸收的途徑之一[15]。除此之外，植物還會通過向根系分泌氫離子或者有機(jī)酸[16-17]，同時(shí)促進(jìn)根際解磷菌的繁殖[18-19]，來提高根際周圍土壤中被土壤黏粒包裹的磷的釋放，從而增加植物根際的可利用磷含量，供植物吸收利用。

植物的細(xì)胞壁是植物抵御外界脅迫的第一道屏障。它在植物抵御鋁毒、鎘毒中發(fā)揮重要作用[20-21]。比如Xiong等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在鎘脅迫下，植物通過增加根系細(xì)胞壁對鎘的吸附，從而減少鎘往地上部的運(yùn)輸，緩解植物鎘毒。近期研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞壁在幫助植物抵抗低磷脅迫中也發(fā)揮重要作用。在水稻根系中，約一半的總磷存在根系細(xì)胞壁中，且在低磷條件下，這部分的磷會通過細(xì)胞壁果膠的調(diào)節(jié)作用而被釋放出來，從而供水稻再利用。同時(shí)，缺磷條件下，水稻根系細(xì)胞壁的果膠含量與水稻體內(nèi)有效磷的含量呈顯著正相關(guān)，說明缺磷時(shí)水稻根系細(xì)胞壁中的果膠含量越高，其對體內(nèi)細(xì)胞壁磷的再利用能力越強(qiáng)[23]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫(H2S)是植物體內(nèi)重要的信號分子[24-25]。H2S在植物體內(nèi)廣泛參與各種生理反應(yīng)，比如植物氣孔的閉合的調(diào)節(jié)[26]，緩解植物硼毒引起的根伸長抑制[27]，緩解鎘在植物體內(nèi)的積累以及造成的氧化損害[28]，降低干旱滲透脅迫[29]以及提高植物耐鹽[30]等。本次試驗(yàn)主要研究缺磷條件下，H2S信號分子通過調(diào)控水稻根系細(xì)胞壁磷的釋放來提高水稻體內(nèi)有效磷的含量。

1 材料與方法

1.1 植物培養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選無病蟲害的水稻種子，在10%(/)的次氯酸鈉(NaClO)溶液中浸泡10 min，用蒸餾水徹底沖洗3遍，將種子放入墊有濕潤濾紙的小培養(yǎng)皿中在黑暗條件下催芽24 h(30℃)；第2天將培養(yǎng)皿中的種子放在塑料網(wǎng)上，在含有0.5 mmol/L氯化鈣(CaCl2)的溶液中(pH 5.5)繼續(xù)萌發(fā)2 d(30℃)；接著將CaCl2溶液徹底換成正常的木村營養(yǎng)液，放在含有正常光照的培養(yǎng)間繼續(xù)培養(yǎng)。

為了解析新型信號分子硫化氫(H2S)調(diào)控缺磷條件下水稻體內(nèi)磷的再利用的機(jī)制，設(shè)置以下試驗(yàn)：將水稻幼苗在正常條件下培養(yǎng)14 d后，選取長勢一致的水稻幼苗移入1.5 L的培養(yǎng)罐中，每個(gè)罐子中培養(yǎng)10棵。在+P(磷含量180 μmol/L)和–P(磷含量0 μmol/L) 兩個(gè)處理組下分別添加0(作為對照)、10、50和100 nmol/L的NaHS溶液，處理24 h后，將營養(yǎng)液完全換掉，繼續(xù)在這兩個(gè)處理(+P和–P)條件下培養(yǎng)6 d。營養(yǎng)液的最終pH為5.5，并且加5 mmol/L的MES緩沖液固定溶液pH。期間每隔3 d換一次營養(yǎng)液。預(yù)備試驗(yàn)顯示，無論在加磷還是缺磷條件下，10 nmol/L NaHS處理24 h后水稻體內(nèi)有效磷含量均達(dá)到最高值，因此選擇該NaHS濃度(10 nmol/L)和處理時(shí)間(24 h)做進(jìn)一步的研究，分別設(shè)置以下處理：+P、–P、+P+S (S代表NaHS)、和–P+S。其余培養(yǎng)條件同上。

為進(jìn)一步驗(yàn)證新型信號分子硫化氫(H2S)參與調(diào)控水稻細(xì)胞壁磷的再利用，設(shè)置亞?；撬?hypotau-rine)添加試驗(yàn)，包括以下4個(gè)處理：+P、–P、+P+HT (HT代表亞?；撬?、和–P+HT。亞?；撬嵩跔I養(yǎng)液中的最終濃度為300 μmol/L。處理7 d后收集水稻的根部和地上部進(jìn)行檢測。營養(yǎng)液的最終pH為5.5，并且加5 mmol/L的MES緩沖液固定溶液pH。期間每隔3 d換一次營養(yǎng)液。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 有效磷含量的測定 首先，將處理后的水稻樣品在蒸餾水下沖洗3次，吸干水分后分別稱重，記錄鮮重。然后，將植物樣品在研缽中用液氮研磨，粉碎后加入0.8 ml的5 mmol/L硫酸溶液，繼續(xù)研磨后加入8 ml蒸餾水，將研磨后的勻漿倒入10 ml的離心管；室溫靜置2 h后，在4 000 r/min下離心5 min；取出400 μl的上清液加入到1.5 ml的離心管中用鉬銻抗比色法進(jìn)行測定[31]。

1.2.2 細(xì)胞壁的提取與組分分離 細(xì)胞壁的提?。菏紫龋瑢⑺靖谡麴s水下沖洗3遍后，紙巾擦干；然后，在研缽中用液氮進(jìn)行研磨，粉碎后用75% 的乙醇將樣品倒入10 ml的離心管中，在冰上間斷混勻，20 min后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min(4℃)，倒掉上清液，依次加入丙酮、1∶1的甲醇和氯仿混合液以及甲醇，每次均在冰上間斷混勻20 min，然后離心，棄上清。加入甲醇離心棄上清后，將剩余的細(xì)胞壁粗提物用冷凍干燥儀冷凍干燥，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹32]。

果膠的提?。悍Q取約2 mg的細(xì)胞壁置于1.5 ml的離心管，加入1 ml蒸餾水，在100℃的水浴鍋中煮1 h；然后，在13 200 r/min條件下離心10 min；吸取上清液放入5 ml的離心管中。重復(fù)在100℃下煮3次，棄去殘?jiān)?。? ml離心管中的液體用蒸餾水定容至3 ml即為提取的果膠[33]。

1.2.3 果膠含量的測定 果膠的含量通過測定糖醛酸的含量來指示。具體的方法如下：吸取200 μl的果膠提取液于1.5 ml離心管中；再加入1 ml含有12.5 mmol/L Na2B4O7·10H2O的濃硫酸；然后將離心管放在沸水中水浴5 min，取出離心管，在冷水中冷卻；往冷卻的離心管中加入20 μl濃度為0.15% 的間羥基聯(lián)苯 3-羥基聯(lián)苯溶液，在室溫下催化反應(yīng)20 min，混勻后在520 nm的波長下進(jìn)行比色。用不同濃度的半乳糖醛酸制作標(biāo)曲[34]。

1.2.4 細(xì)胞壁磷的測定 稱取約2 mg的粗提細(xì)胞壁，將其放入1.5 ml的離心管中，往離心管中加入1 ml 2 mol/L的鹽酸；然后，在渦旋振蕩儀上進(jìn)行振蕩，放入振蕩器中振蕩24 h；取出離心管，在13 200 r/min下離心5 min，取上清在電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀上測定磷含量[23]。

1.2.5 果膠甲酯酶酶活的測定 在冰上稱取約5 mg的細(xì)胞壁粗提物，加入0.5 ml的1 mol/L NaCl溶液，在冰上間隔地用渦旋振蕩儀振蕩1 h；然后，在15 000 r/min下離心10 min(4℃)，取上清測定果膠甲酯酶活性。具體方法為：取50 μl提取的上清加入1.5 ml離心管，往離心管中分別加入100 μl含有0.64 mg/ml果膠的200 mmol/L PBS 緩沖液和10 μl酒精氧化酶溶液；在30℃條件下反應(yīng)10 min后，加入200 μl含有5 mg/ml 4-氨基-5-肼基-1,2,4-三唑-3-硫醇的0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液；繼續(xù)在30℃下保持30 min，然后加入640 μl蒸餾水后在550 nm波長下比色。用不同濃度的甲醇作標(biāo)曲[35]。

1.2.6 硫化氫(H2S)含量的測定 將水稻根在蒸餾水中洗凈，稱取鮮重；在液氮下研磨后加入5 ml含有0.1 mmol/L EDTA以及0.2 mmol/L抗壞血酸的磷酸緩沖液(pH 6.8；50 mmol/L)；然后，將勻漿液裝入含有100 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)、10 mmol/L L-半胱氨酸和2 mmol/L磷酸吡哆醛的測試管中，在室溫下靜置30 min；接著，加入0.3 ml 5 mmol/L的溶解在3.5 mmol/L硫酸中的二甲基-p-苯二胺，再加入0.3 ml 50 mmol/L的溶解在100 mmol/L硫酸中的硫酸鐵銨；反應(yīng)15 min后在667 nm波長下進(jìn)行比色。用硫化鈉做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后值換算成nmol/g FW[36]。

1.2.7 基因表達(dá)的測定 收集處理后的水稻根系，在研缽中用液氮徹底研磨，用TRIZOL (Invitrogen, Inc., CA, USA)提取根系的總RNA。提取后的RNA在nanodrop上測定含量以及質(zhì)量，在1% 的瓊脂糖介質(zhì)下進(jìn)行電泳檢測其完整性。然后，用PrimeScript RT 試劑盒 (Takara Bio, Inc., Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系中含有1 μg的總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系為10 μl，包含：1 μl稀釋10倍的cDNA，0.6 μl的正向和反向引物，5 μl的SYBR Premix ExTaq(Takara Bio, Inc., Japan)和2.8 μl的滅菌水。反應(yīng)的引物序列如下：2(正向引物: 5′-GACGAGACCG CCCAAGAAG-3′，反向引物: 5′-TTTTCAGTCACTC ACGTCGAGAC-3′)，6(正向引物: 5′-TATAA CTGATCGATCGAGACCAGAG-3′；反向引物:5′-TG GATAGCCAGGCCAGTTATATATC-3′)，8(正向引物:5′-AGAAGGCAAAAGAAATGTGTGTTAAAT- 3′，反向引物: 5′-AAAATGTATTCGTGCCAAATTGCT- 3′)。每個(gè)樣品做3個(gè)機(jī)械重復(fù)以及3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以基因作為內(nèi)參基因(正向引物: 5′-AAGTTCTG GGAAGTGGTT-3′，反向引物: 5′-CTCCCAATGAGT GACAAA-3′)，用2-ΔΔCT方法進(jìn)行基因相對表達(dá)量的計(jì)算[37-38]。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S對水稻體內(nèi)有效磷含量的影響

由圖1可見，在添加10 nmol/L的NaHS后，水稻根系和地上部的有效磷含量均顯著增加(圖1)，說明10 nmol/L的NaHS對水稻磷吸收和體內(nèi)再利用試驗(yàn)來說是一個(gè)合適的處理濃度。并且在完全缺磷的營養(yǎng)液中，10 nmol/L NaHS可以提高水稻體內(nèi)有效磷的含量，說明在缺磷條件下，H2S會通過促進(jìn)水稻體內(nèi)磷的再利用，從而提高體內(nèi)的有效磷含量。

(圖中不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平顯著，下同)

2.2 水稻體內(nèi)H2S含量

鑒于10 nmol/L的NaHS可以顯著地提高缺磷條件下水稻根部和地上部的有效磷含量，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中選擇該濃度做進(jìn)一步的研究。用NaHS預(yù)處理水稻1 d以后，水稻根系H2S含量顯著增加(圖2)，暗示確實(shí)是H2S促進(jìn)了缺磷條件下水稻體內(nèi)有效磷含量的增加。

2.3 水稻體內(nèi)細(xì)胞壁磷含量、果膠含量和果膠甲酯酶活性

前人研究發(fā)現(xiàn)，水稻根中約有50% 的總磷儲存在根系的細(xì)胞壁中[23]，據(jù)此推測在缺磷條件下，H2S調(diào)控促進(jìn)了水稻根系細(xì)胞壁磷的再利用。結(jié)果顯示，在用NaHS預(yù)處理后，缺磷條件下，水稻根系細(xì)胞壁中的磷含量顯著減少(圖3A)，且伴隨細(xì)胞壁果膠含量的上升(圖3B)以及果膠甲酯酶活性的上升(圖3C)，表明H2S確實(shí)可以通過提高水稻細(xì)胞壁內(nèi)果膠的含量以及酸化程度來促進(jìn)細(xì)胞壁磷的釋放，從而提高體內(nèi)的有效磷含量。

2.4 水稻體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)

水稻體內(nèi)有眾多的磷轉(zhuǎn)運(yùn)子參與水稻對外界磷的吸收以及體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，磷轉(zhuǎn)運(yùn)子OsPT2、OsPT6以及OsPT8主要參與水稻體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)[37-38]，因此在本次試驗(yàn)中，主要測定了這3個(gè)磷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因在添加NaHS后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在缺磷1 d后，26以及8基因的表達(dá)均顯著上升，并且在缺磷條件下，10 nmol/L NaHS預(yù)處理的水稻根中6和8基因的表達(dá)量顯著高于單純?nèi)绷滋幚?圖4)，表明H2S主要通過調(diào)節(jié)6和8基因的表達(dá)來增加其有效磷從根部往地上部的運(yùn)輸。

圖2 水稻根中H2S含量

圖3 水稻根系細(xì)胞壁的磷含量(A)、果膠含量(B)以及果膠甲酯酶的活性(C)

圖4 水稻根中OsPT2(A)、OsPT6(B)和OsPT8(C)基因的表達(dá)

2.5 H2S清除劑對水稻有效磷以及細(xì)胞壁磷含量及組分變化的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)H2S在缺磷條件下對水稻細(xì)胞壁磷再利用的調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)在營養(yǎng)液中外源添加了H2S的清除劑亞?；撬帷＝Y(jié)果顯示，在缺磷條件下，當(dāng)水稻的營養(yǎng)液中存在亞?；撬岷螅涓亢偷厣喜康挠行Я缀烤@著下降(圖5)，并且伴隨著果膠含量的下降和果膠甲酯酶活性的下降以及根部細(xì)胞壁磷含量的上升(圖6)。以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了H2S在水稻缺磷條件下，通過改變水稻根系細(xì)胞壁組分來提高細(xì)胞壁磷的再利用，以提高水稻體內(nèi)有效磷的含量使其正常生長。

3 討論

信號分子H2S在植物的眾多抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。比如對苜蓿()抵抗鎘毒的研究中發(fā)現(xiàn)，在含鎘的溶液中添加H2S的供體NaHS后，苜蓿體內(nèi)的鎘含量明顯減少，并且伴隨著氧化損傷的降低，說明H2S不僅可以減少植物對重金屬鎘的吸收，還能通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來減少由于重金屬脅迫造成的氧化損傷。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，H2S還能刺激根系NO含量的增加，說明H2S在調(diào)控植物抵御重金屬脅迫的過程中還與信號分子NO密切相關(guān)[28]。最近，有學(xué)者在玉米抵抗高溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，H2S在NO的下游發(fā)揮作用，幫助玉米抵抗高溫脅迫引起的各種損傷[36]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)外源添加10 nmol/L的H2S供體NaHS后，在缺磷條件下，水稻根部和地上部的有效磷含量顯著增加(圖1)，并且伴隨著水稻體內(nèi)H2S含量的上升，表明H2S信號分子通過調(diào)控水稻體內(nèi)磷的再利用來增加水稻體內(nèi)有效磷含量。

圖5 添加亞牛磺酸后水稻根部(A)和地上部(B)有效磷含量

圖6 添加亞?；撬岷笏靖导?xì)胞壁磷含量(A)、果膠含量(B)以及果膠甲酯酶的活性(C)

水稻根系細(xì)胞壁在水稻增加外部磷吸收以及提高體內(nèi)磷的再利用過程中起重要作用。Ae等[39]報(bào)道低磷條件下的花生，其細(xì)胞壁多糖具有活化磷的能力。隨后，Ae等[40]通過比較缺磷土壤上的多種作物發(fā)現(xiàn)，植物吸收磷的多少主要取決于植物根系細(xì)胞壁對外界難溶態(tài)磷的溶解作用，稱為“contact reaction”。因此，相對于高粱以及大豆，花生具有較高的耐缺磷性的原因主要在于它的根系細(xì)胞壁對難溶態(tài)磷的活化與再利用能力更高，是高粱和大豆的兩倍。Zhu等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下Nip體內(nèi)的有效磷含量顯著高于Kas，其主要原因是Nip水稻根系中的果膠含量顯著高于Kas，從而提高了其對細(xì)胞壁磷的再利用。并且在含F(xiàn)ePO4的溶液中分別外源添加果膠和水，一段時(shí)間后測定溶液中的PO3– 4含量，發(fā)現(xiàn)添加果膠的溶液中PO3– 4的含量顯著高于單純添加水的溶液中，由此說明果膠可以通過吸附與PO3– 4結(jié)合的陽離子(比如Fe3+)，從而促使PO3– 4離子的釋放，進(jìn)而增加水稻細(xì)胞壁中磷的釋放。最近的研究發(fā)現(xiàn)，信號分子NO以及植物激素乙烯，均可以通過提高水稻根系細(xì)胞壁中果膠的含量以及果膠甲酯酶的活性來提高細(xì)胞壁磷的釋放，從而增加缺磷條件下水稻體內(nèi)的有效磷含量[41-42]。植物細(xì)胞壁中的果膠主要在高爾基體中形成，此時(shí)形成的果膠因?yàn)楦叨鹊募柞セ鴰в猩倭康呢?fù)電荷，因此與陽離子的結(jié)合能力較弱[43]。高度甲酯化的果膠經(jīng)過分泌進(jìn)入細(xì)胞壁后，在果膠甲酯酶的催化下脫去甲酯，暴露出其中的羧基(—COO–—)，從而增加對細(xì)胞壁中與磷結(jié)合的陽離子(如FePO4中的Fe3+)的吸收，促使其中的PO3– 4釋放出來，供植物進(jìn)一步利用。本次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下外源添加H2S的供體NaHS后，水稻根系中的細(xì)胞壁磷含量顯著下降，并且伴隨著果膠含量的上升和果膠甲酯酶活性的增加(圖3)，說明H2S通過提高細(xì)胞壁磷的釋放來增加體內(nèi)的有效磷含量。H2S清除劑亞?；撬岬奶砑釉囼?yàn)進(jìn)一步證明，H2S確實(shí)可以通過增加細(xì)胞壁中果膠含量以及提高細(xì)胞壁果膠甲酯酶的活性來提高對細(xì)胞壁磷的釋放(圖6)。

水稻體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)子不僅負(fù)責(zé)水稻根系對外界磷的吸收，還與水稻體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。前人的研究發(fā)現(xiàn)，水稻體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)子OsPT2、OsPT6以及OsPT8主要負(fù)責(zé)水稻體內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)[37-38]。對2和6基因的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在水稻中敲除2或6基因后，水稻根部向地上部磷的運(yùn)輸顯著減少，說明這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄翻譯的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)水稻體內(nèi)磷從根系往地上部的運(yùn)輸[38]。當(dāng)敲除8基因后，無論在低磷還是高磷條件下，水稻體內(nèi)的磷含量以及植物生長均顯著減少和降低，并且伴隨著在花序中磷含量的增加和在空籽粒中磷含量的減少，暗示8在調(diào)控水稻體內(nèi)磷平衡過程中起重要作用[37]。在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下，在營養(yǎng)液中添加H2S的供體NaHS后，水稻根中6和8基因的表達(dá)均顯著高于單純的缺磷條件(圖4)，說明H2S通過調(diào)控這兩個(gè)基因的表達(dá)來促使水稻體內(nèi)磷從根部往地上部的運(yùn)輸以及調(diào)節(jié)體內(nèi)磷的平衡。

4 結(jié)論

缺磷條件下，信號分子H2S通過增加水稻細(xì)胞壁中果膠的含量以及果膠甲酯酶的活性來促進(jìn)水稻細(xì)胞壁磷的釋放，從而增加水稻體內(nèi)的有效磷含量；并且通過調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)子6和8基因的表達(dá)來促進(jìn)水稻體內(nèi)磷的運(yùn)輸以及調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)磷的平衡。

[1] Marschner, H. Mineral Nutrition of Higher Plants (2nded.)[M]. London: 1995

[2] Vance C P, Uhde-Stone C, Allan D L. Phosphorus acqui-sition and use: Critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource[J]. New Phytologist, 2003, 157(3): 423–447

[3] Raghothama, K. Phosphate acquisition[J]. Annual Review of Plant Biology, 1999, 50(1): 665–693

[4] Gong Y, Guo Z, He L, et al. Identification of maize genotypes with high tolerance or sensitivity to phosphorus deficiency[J]. Journal of Plant Nutrition, 2011, 34(9): 1290–1302

[5] 李繼云, 李振聲. 有效利用土壤營養(yǎng)元素的作物育種新技術(shù)研究[J]. 中國科學(xué): B輯, 1995, 25(1): 41–48

[6] Bieleski, R. Phosphate pools, phosphate transport, and phosphate availability[J]. Annual Review of Plant Phy-siology, 1973, 24(1): 225–252

[7] Tiessen H. Phosphorus in the global environment, in The ecophysiology of plant-phosphorus interactions[M]. Nethe-rlands: Springer, 2008: 1–7

[8] 江尚燾, 王火焰, 周健民, 等. 磷肥施用對水稻生長和磷素吸收的影響[J]. 土壤, 2016. 48(6): 1085–1091

[9] 王火焰, 周健民. 根區(qū)施肥——提高肥料養(yǎng)分利用率和減少面源污染的關(guān)鍵和必需措施[J]. 土壤, 2013, 45(5): 785–790

[10] Forde B, Lorenzo H. The nutritional control of root development[J]. Plant and Soil, 2001, 232(1/2): 51–68

[11] Ericsson T. Growth and shoot: root ratio of seedlings in relation to nutrient availability, in Nutrient uptake and cycling in forest ecosystems[M]. Netherlands: Springer, 1995: 205–214

[12] Steingrobe B, Schmid H, Claassen N. Root production and root mortality of winter barley and its implication with regard to phosphate acquisition[J]. Plant and Soil, 2001, 237(2): 239–248

[13] Keerthisinghe G, Hocking P, Ryan P, et al. Effect of phosphorus supply on the formation and function of pro-teoid roots of white lupin (L.)[J]. Plant, Cell & Environment, 1998, 21(5): 467–478

[14] Lynch J P, Brown K M. Topsoil foraging–an architectural adaptation of plants to low phosphorus Availability[J]. Plant and Soil, 2001, 237(2): 225–237

[15] Brundrett M C. Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants[J]. New Phytologist, 2002, 154(2): 275–304

[16] Hinsinger P. Bioavailability of soil inorganic P in the rhizosphere as affected by root-induced chemical changes: A review[J]. Plant and Soil, 2001, 237(2): 173–195

[17] Ae N, Arihara J, Okada K, et al. Phosphorus uptake by pigeon pea and its role in cropping systems of the Indian subcontinent[J]. Science, 1990, 248(4954): 477–480

[18] 孫婷婷, 陳晏, 樊劍波, 等. 土壤懸液培養(yǎng)法研究長期施肥下花生根際解磷菌溶磷特性[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2017, 54(1): 227–236

[19] 梅新蘭, 閃安琪, 蔣益, 等. 適應(yīng)玉米的溶磷細(xì)菌篩選及其對玉米生長的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2016, 53(2): 502– 509

[20] Zhu X F, Lei G J, Wang Z W, et al. Coordination between apoplastic and symplastic detoxification confers plant alumi-num resistance[J]. Plant Physiology, 2013, 162(4): 1947–1955

[21] Zhu X F, Wang Z W, Dong F, et al. Exogenous auxin alleviates cadmium toxicity inby stimulating synthesis of hemicellulose 1 and increasing the cadmium fixation capacity of root cell walls[J]. Journal of Hazardous Materials, 2013, 263: 398–403

[22] Xiong J, An L, Lu H, et al. Exogenous nitric oxide enhances cadmium tolerance of rice by increasing pectin and hemicellulose contents in root cell wall[J]. Planta, 2009, 230(4): 755–765

[23] Zhu X F, Wang Z W, Wan J X, et al. Pectin enhances rice () root phosphorus remobilization[J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(3): 1017–1024

[24] García-Mata C, Lamattina L. Hydrogen sulphide, a novel gasotransmitter involved in guard cell signalling[J]. New Phytologist, 2010, 188(4): 977–984

[25] Lisjak M, Srivastava N, Teklic T, et al. A novel hydrogen sulfide donor causes stomatal opening and reduces nitric oxide accumulation. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48(12): 931–935

[26] García-Mata C, Lamattina L. Hydrogen sulphide, a novel gasotransmitter involved in guard cell signalling[J]. New Phytologist, 2010, 188(4): 977–984

[27] Wang B L, Shi L, Li Y X , et al. Boron toxicity is alleviated by hydrogen sulfide in cucumber (L.) seedlings[J]. Planta, 2010, 231(6): 1301–1309

[28] Li L, Wang Y, Shen W. Roles of hydrogen sulfide and nitric oxide in the alleviation of cadmium-induced oxida-tive damage in alfalfa seedling roots[J]. Biometals, 2012, 25(3): 617–631

[29] Zhang H, Ye Y K, Wang S H, et al. Hydrogen sulfide counteracts chlorophyll loss in sweetpotato seedling leaves and alleviates oxidative damage against osmotic stress[J]. Plant Growth Regulation, 2009, 58(3): 243–250

[30] Zhu J K. Plant salt tolerance[J]. Trends in Plant Science, 2001, 6(2): 66–71

[31] Zheng L, Huang F, Narsai R, et al. Physiological and transcriptome analysis of iron and phosphorus interaction in rice seedlings[J]. Plant Physiology, 2009,151(1): 262– 274

[32] Zhong H, Lauchli A. Changes of cell wall composition and polymer size in primary roots of cotton seedlings under high salinity[J]. Journal of Experimental Botany, 1993, 44(4): 773–778

[33] Yang J L, Zhu X F, Peng Y X, et al. Cell wall hemice-llulose contributes significantly to aluminum adsorption and root growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology, 2011, 155(4): 1885–1892

[34] Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids[J]. Analytical Biochemistry, 1973, 54(2): 484–489

[35] Zhu X F, Shi Y Z, Lei G J, et al. XTH31, encoding an in vitro XEH/XET-active enzyme, regulates aluminum sensi-tivity by modulating in vivo XET action, cell wall xyloglu-can content, and aluminum binding capacity in Arabido-psis[J]. The Plant Cell, 2012, 24(11): 4731–4747

[36] Li Z G, Yang S Z, Long W B, et al. Hydrogen sulphide may be a novel downstream signal molecule in nitric oxide-induced heat tolerance of maize (L.) seedlings[J]. Plant, Cell & Environment, 2013, 36(8): 1564–1572

[37] Jia H, Ren H, Gu M, et al. The phosphate transporter gene OsPht1; 8 is involved in phosphate homeostasis in rice[J]. Plant Physiology, 2011, 156(3): 1164–1175

[38] Ai P, Sun S, Zhao J, et al. Two rice phosphate transporters, OsPht1; 2 and OsPht1; 6, have different functions and kinetic properties in uptake and translocation[J]. The Plant Journal, 2009, 57(5): 798–809

[39] Ae N, Otani T, Makino T, et al. Role of cell wall of groundnut roots in solubilizing sparingly soluble phosp-horus in soil[J]. Plant and Soil, 1996, 186(2): 197–204

[40] Ae N, Shen R F. Root cell-wall properties are proposed to contribute to phosphorus (P) mobilization by groundnut and pigeonpea[J]. Plant and Soil, 2002, 245(1): 95–103

[41] Zhu X F, Zhu C Q, Zhao X S, et al. Ethylene is involved in root phosphorus remobilization in rice () by regulating cell-wall pectin and enhancing phosphate translocation to shoots[J]. Annals of Botany, 2016, 118(4): 645–653

[42] Zhu C Q, Zhu X F, Hu A Y, et al. Differential effects of nitrogen forms on cell wall phosphorus remobilization are mediated by nitric oxide, pectin content and phosphate transporter ex-pression[J]. Plant Physiology, 2016, 171(2): 1407

[43] Micheli F. Pectin methylesterases: Cell wall enzymes with important roles in plant physiology[J]. Trends in Plant Science, 2001, 6(9): 414–419

Hydrogen Sulfide Promote Rice () Cell Wall P Remobilization Under P Starvation Condition

ZHU Chunquan1,2, ZHU Xiaofang1, SHEN Renfang1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Exogenous addition of 10 nmol/L H2S donor NaHS significantly increased available P content in rice under P starvation condition. Further study demonstrated that H2S positively stimulated the increase of pectin content, accompanied with the enhancement of pectin methylesterase (PME) activity, then increased the cell wall P release, finally helped rice to survive underno P condition. What’s more, the addition of H2S scavenger hypotaurine (HP) further emphasized the important roles of H2S in rice root cell wall P release. In addition, H2S stimulated the expressions of phosphate transporter genes6and8 which are involved in the transport of soluble P from root to shoot.

Signal molecular; H2S; Cell wall; Pectin; Pectin methylesterase (PME); Phosphate transporter gene

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB441000)和中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDB15030302，XDB15030202)資助。

(rfshen@issas.ac.cn)

朱春權(quán)(1987—)，男，浙江嘉興人，博士研究生，研究方向?yàn)槿绷讞l件下植物根系細(xì)胞壁磷的再利用。E-mail：cqzhu@issas.ac.cn

10.13758/j.cnki.tr.2018.01.007

Q945.12

A