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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院心血管內(nèi)科)

血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化即由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化在動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓、支架內(nèi)再狹窄等血管增生性疾病中起重要作用[1-3]，但調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制仍不明確。研究表明氧化應(yīng)激參與VSMCs表型轉(zhuǎn)化[4]，而VSMCs內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)主要來源于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶。血管過氧化物酶1(Vascular Peroxidase 1，VPO1)是一種新型的過氧化物酶，能催化NADPH氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox)來源的過氧化氫(H2O2)產(chǎn)生氧化能力更強(qiáng)的次氯酸(Hypochlorous Acid，HOCl)加劇氧化應(yīng)激[5]。血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)通過上調(diào)Nox來源的ROS水平調(diào)節(jié)VSMCs的增殖和遷移[6]，也有研究表明VPO1在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs增殖中起重要作用[7]。因此推測，Ang-Ⅱ上調(diào)VSMCs內(nèi)VPO1的表達(dá)，并通過加劇氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1材料DMEM培養(yǎng)基購自美國Corning公司，胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，兔VPO1抗體、兔α-SMA抗體、兔SM22α抗體、兔KLF4抗體、兔OPN抗體、兔GAPDH一抗、3-氯酪氨酸抗體均購自美國Abcam公司，BCA蛋白定量試劑盒、H2O2檢測試劑盒、western blot 一抗稀釋液均購自江蘇碧云天生物有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，VPO1siRNA、NC-siRNA購自中國廣州銳博生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，PCR引物購自中國上海程生物公司，Real-PCR試劑盒日本Takara公司。

1.2原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞提取、培養(yǎng)選體重約為100～120 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后置于75%乙醇溶液中浸泡3 min后處死。剪開胸腔，分離并剪開主動(dòng)脈，剔除內(nèi)皮細(xì)胞和血管外膜，將動(dòng)脈中膜剪成約2 mm×2 mm大小的組織塊均勻平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底壁，加入含20%胎牛血清、雙抗(100 U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素)、4.5 g/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞鋪滿瓶底面積約80%～90%后用清除組織塊，予以0.25%胰蛋白酶消化傳代。3～8代細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3免疫熒光鑒定血管平滑肌細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞密度生長約為60%，PBS潤洗3次，每次10 min，4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3次后以0.1% Triton-X 100 室溫處理20 min，5%BSA室溫封閉30 min，加平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜后PBS 漂洗3次，每次10 min，加熒光二抗 (1∶1 000)，避光孵育60 min，PBS漂洗后滴加DAPI(1∶10 000)5 min，PBS漂洗晾干后以10%甘油封片，避光保存，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 VPO1siRNA(si-VPO1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種約1×106個(gè)細(xì)胞至6孔板內(nèi)，待每孔細(xì)胞密度生長約為30%～50%時(shí)，采用轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L siRNA嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后用real-time PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。VPO1siRNA干擾序列為：5′-GUGGACUUGAAUGGAACAATT-3，由廣州銳博生物公司合成，陰性對(duì)照siRNA(si-NC) 由該公司提供。

1.5 wstern blot蛋白檢測提取細(xì)胞總蛋白，嚴(yán)格按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度，取50 μg樣本蛋白在10%SDS-PAGE的分離膠上進(jìn)行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中室溫下?lián)u床上緩慢搖動(dòng)封閉1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)濃度的一抗孵育，4 ℃過夜后復(fù)溫1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行半定量分析。

1.6 Real-Time PCR mRNA檢測使用Trizol(Invitrogen，USA)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，并按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit(TakaRa，Japan)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Foster City，USA)進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，用ΔΔCt方法進(jìn)行定量。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.7 H2O2的檢測收集細(xì)胞到離心管，加入適量的H2O2裂解液充分勻漿裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 rpm離心5 min，取上清做后續(xù)測定。H2O2檢測試劑冰上溶解，標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成1、2、5、10、20、50 μmol/L，用96孔板檢測，每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品后，每孔再加入100 μL H2O2檢測試劑，輕輕震蕩混勻，室溫靜置30 min，立即測定A560的吸光值。

1.8 HOCl的檢測因HOCl是一種氧化能力強(qiáng)且很不穩(wěn)定的氧化劑，能與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生氧化反應(yīng)，生成穩(wěn)定3-氯酪氨酸，因此通過western blot 檢測3-氯酪氨酸表達(dá)情況可間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)HOCl的生成[7]。

1.9統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。兩組間比較檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性后采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1原代VSMCs的鑒定α-SMA是VSMCs的特征性抗原之一，采用免疫熒光檢測α-SMA鑒定VSMCs，結(jié)果顯示提取的原代細(xì)胞中95%以上α-SMA免疫熒光染色呈陽性。見圖1。

圖1 免疫熒光鑒定VSMCs

2.2 Ang-Ⅱ?qū)SMCs內(nèi)VPO1蛋白及mRNA表達(dá)的影響以不同濃度的Ang-Ⅱ(0 nmol/L、10 nmol /L、100 nmol/L、1 μmol/L)孵育VSMCs 24 h發(fā)現(xiàn)VSMCs內(nèi)VPO1蛋白及mRNA的表達(dá)均呈濃度依賴性的升高。以終濃度為100 nmol/L的Ang-Ⅱ孵育VSMCs 0、12、24、48 h發(fā)現(xiàn)VSMCs內(nèi)VPO1蛋白及mRNA均呈時(shí)間依賴性的升高。見圖2。

圖2 Ang-Ⅱ?qū)SMCs內(nèi)VPO1蛋白及mRNA表達(dá)的影響(n=4)A：western blot 檢測VPO1蛋白表達(dá)的量效關(guān)系；B：RT-PCR檢測VPO1mRNA表達(dá)的量效關(guān)系；C：western blot 檢測VPO1蛋白表達(dá)的時(shí)效關(guān)系；D：RT-PCR檢測VPO1mRNA表達(dá)的時(shí)效關(guān)系. 與Ang-Ⅱ0 nmol/L 0或0 h組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 Ang-Ⅱ?qū)SMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白和KLF4蛋白表達(dá)的影響α-SMA、平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)是VSMCs收縮型標(biāo)記蛋白，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是VSMCs合成型的標(biāo)記蛋白，Krüppel樣因子4(KLF4)是調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，觀察SM22α、α-SMA、OPN和KLF4蛋白的表達(dá)變化可評(píng)估VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。與對(duì)照組相比，以濃度為100 nmol/L Ang-Ⅱ孵育VSMCs 24 h后SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)明顯下降，而OPN、KLF4蛋白表達(dá)明顯升高。見圖3。

圖3 Ang-Ⅱ?qū)SMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白和KLF4蛋白表達(dá)的影響(n=4)A：western blot 檢測SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的表達(dá)； B：SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的相對(duì)表達(dá). 與Control比較，**P<0.01

2.4 VPO1基因沉默的鑒定與空白轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染si-VPO1組的VSMCs內(nèi)VPO1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降。見圖4。

圖4 VPO1基因沉默的鑒定(n=4)A：Real-time PCR檢測VSMCs轉(zhuǎn)染VPO1 siRNA后VPO1 mRNA的表達(dá)；B：Western Blot 檢測VSMCs轉(zhuǎn)染VPO1 siRNA后蛋白的表達(dá). 與對(duì)照組相比，**P<0.01

2.5 VPO1基因沉默對(duì)Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白及KLF4蛋白表達(dá)的影響分別予以陰性對(duì)照siRNA (negative control siRNA) 或VPO1si RNA轉(zhuǎn)染VSMCs 24 h，然后予以終濃度為100 nmol/L Ang-Ⅱ或不含Ang-Ⅱ的培養(yǎng)液VSMCs 24 h。結(jié)果顯示：與si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-NC組VSMCs內(nèi)SM22α、α-SMA 蛋白減少，見圖5。而OPN、KLF4蛋白表達(dá)增加；與Ang-Ⅱ+ si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO1組VSMCs內(nèi)SM22α、α-SMA 蛋白表達(dá)增加，而OPN、KLF4蛋白表達(dá)減少。見圖5。

圖5 VPO1基因沉默對(duì)Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白及KLF4蛋白表達(dá)的影響(n=4)A：Western blot檢測α-SMA 、SM22α、OPN、KLF4蛋白表達(dá)；B：SM22α、α-SMA 、OPN、KFL4蛋白的相對(duì)表達(dá).與NC-si RNA(-)組比較，**P<0.01；與NC-si(+)組比較，#P<0.05

2.6 VPO1基因沉默對(duì)Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs生成H2O2、HOCl的影響與si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-NC組上清液中H2O2的生成增加；與Ang-Ⅱ+si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO組上清液中H2O2的生成減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-NC組3-氯絡(luò)氨酸蛋白表達(dá)增加；與Ang-Ⅱ+si-NC組相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO組3-氯絡(luò)氨酸蛋白表達(dá)減少。見圖6。

2.7 HOCl對(duì)VSMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白及KLF4蛋白表達(dá)的影響鑒于VPO1通過催化H2O2生成HOCl起作用，予以終濃度100 μmol/L HOCl培養(yǎng)VSMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，HOCl組SM22α、α-SMA 蛋白表達(dá)減少，而OPN、KLF4蛋白表達(dá)增加。見圖7。

圖6 VPO1基因沉默對(duì)Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs 生成H2O2、HOCl的影響(n=4)A：可見光光度法檢測H2O2濃度；B：western blot檢測3-氯絡(luò)氨酸的表達(dá)間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)HOCl的生成. 與NC-si RNA(-)組相比，**P<0.01

圖7 HOCl對(duì)VSMCs相關(guān)標(biāo)記蛋白及KLF4蛋白的影響(n=4)A：western blot 檢測SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的表達(dá)；B：SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的相對(duì)表達(dá). 與Control比較，**P<0.05

3 討 論

VSMCs表型轉(zhuǎn)化是其增殖、遷移及合成細(xì)胞外基質(zhì)的前提，在動(dòng)脈粥樣硬化等血管增生性疾病中起重要作用[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)VSMCs在人類新生內(nèi)膜中大量聚集，被Allahverdian S 等[9]認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是主要來源于VSMCs而非巨噬細(xì)胞參與的疾病。新近發(fā)表于Nature medicine研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型斑塊內(nèi)約80%的VSMCs收縮型標(biāo)記蛋白α-SMA表達(dá)陰性，進(jìn)一步證實(shí)VSMCs表型轉(zhuǎn)化在動(dòng)脈粥樣硬化中作用[10]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，本課題予以Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ang-Ⅱ下調(diào)VSMCs收縮型標(biāo)志蛋白SM22α、α-SMA的表達(dá)和上調(diào)合成型標(biāo)志蛋白OPN的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子KLF4蛋白表達(dá)增加，表明Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化。

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和(或)抗氧化應(yīng)激能力降低，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。Rodriguez AI等[11]研究發(fā)現(xiàn)周期性拉伸的加強(qiáng)通過增加Nox1來源的ROS促進(jìn)VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化參與血管重構(gòu)，表明Nox來源的ROS在VSMCs的表型轉(zhuǎn)化中起重要作用。最近在VSMCs內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種新型過氧化物酶即VPO1，類似于髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，能催化Nox來源的H2O2(弱氧化劑)產(chǎn)生HOCl(強(qiáng)氧化劑)加劇氧化應(yīng)激損傷，在調(diào)節(jié)VSMCs增殖、成骨樣轉(zhuǎn)化及參與自發(fā)性高血壓大鼠的血管重構(gòu)中起重要作用[7,12,13]。本課題結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化過程中，Ang-Ⅱ呈濃度和時(shí)間依賴性升高VSMCs內(nèi)VPO1表達(dá)，伴隨著H2O2和HOCl的生成增加。沉默VPO1基因后能明顯抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs收縮型標(biāo)記蛋白SM22α、α-SMA表達(dá)的減少和OPN表達(dá)的升高，伴隨著細(xì)胞內(nèi)HOCl生成減少?；赩PO1通過催化H2O2生成HOCl起作用，予以HOCl培養(yǎng)VSMCs，同樣發(fā)現(xiàn)SM22α、α-SMA蛋白表達(dá)減少，而OPN蛋白表達(dá)增加，表明VPO1/HOCl途徑參與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。

KLF4作為鋅指結(jié)構(gòu)核轉(zhuǎn)錄因子 KLFs 家族重要成員之一，在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中起重要的調(diào)節(jié)作[14,15]。本課題予以Ang-Ⅱ培養(yǎng)VSMCs誘導(dǎo)其表型轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ang-Ⅱ升高VSMCs內(nèi)VPO1表達(dá)的同時(shí)上調(diào)KLF4蛋白表達(dá)。沉默VPO1基因后明顯抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)KFL4蛋白的升高，表明VPO1通過調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)參與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。同樣我們予以HOCl培養(yǎng)VSMCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)KLF4蛋白表達(dá)明顯增加。

總之，本課題在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化伴隨VPO1蛋白的表達(dá)升高，并通過VPO1/HOCl途徑調(diào)節(jié)KLF4蛋白的表達(dá)在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化中起重要作用。

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