， ， *

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京100069；2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)是心血管疾病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[1]，可通過多種機(jī)制如氧化應(yīng)激[2]、炎癥反應(yīng)[3]、免疫異常[4]等引起心血管病變。有研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)可直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]及心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)還存在另一種重要的死亡調(diào)節(jié)方式，即細(xì)胞自噬(autophagy)。研究表明[7,8]，自噬與凋亡在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化，自噬水平的降低可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。對(duì)于終末分化的心肌細(xì)胞來說，自噬與凋亡都是直接影響細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素，而Hcy是否可能直接抑制心肌細(xì)胞自噬，目前尚不清楚。為此，本研究擬利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究Hcy對(duì)心肌細(xì)胞自噬水平的影響，并且初步探討其中的調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在為揭示HHcy對(duì)心血管的損傷機(jī)制提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；Hcy試劑(Sigma-Aldrich公司，美國)；LC3雙標(biāo)腺病毒Ad-GFP-RFP-LC3購自漢恒生物公司；LC3抗體、mTOR抗體、p-mTOR抗體、P70 S6K抗體、p-P70 S6K抗體(Cell Signaling Technology，美國)、GAPDH抗體、山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記和山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(Santa Cruz公司，美國)；Annexin V-Alexa Fluor 488/PI kit凋亡檢測(cè)試劑盒購自四正柏生物公司。 酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國)； Western blot電泳儀，Western blot電轉(zhuǎn)儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2主要方法

1.2.1 原代乳鼠心肌細(xì)胞提取 選取正常SD大鼠0～3天乳鼠(雌雄不限)，手持乳鼠為其全身噴灑75%酒精進(jìn)行消毒，而后用剪刀從劍突左緣剪開胸骨暴露心臟，迅速取出心臟并放入冰冷PBS中浸泡清洗。使用眼科剪將心臟充分剪碎至1 mm3碎塊后收集至50 mL離心管，加入適量PBS，1000 rpm，37 ℃離心5 min。棄掉PBS，加入1 mL消化酶混合液，于37 ℃水浴中搖動(dòng)消化3 min，將酶懸液吸出加入到含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中終止消化，如此反復(fù)添加酶混合液至心臟組織消化完全。收集消化液與培養(yǎng)基混合液，1 000 rpm，37 ℃，離心10 min， 加入新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，貼壁 1.5 h后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到新的離心管中，1 000 rpm，37 ℃，離心10 min，收集細(xì)胞，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，重新接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，所得即為乳鼠心肌細(xì)胞(Neonatal rat cardiomyocytes，NRCMs)。

1.2.2 細(xì)胞α-actinin熒光染色 原代乳鼠心肌細(xì)胞貼壁48 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2 min，3次。使用4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞20 min，PBS清洗5 min，3次，而后使用5% 的血清白蛋白封閉液室溫孵育30 min，PBS清洗5 min，3次。一抗(α-actinin，1∶2 000比例稀釋)孵育4 ℃過夜，PBS清洗5 min，3次。加入對(duì)應(yīng)二抗避光室溫孵育1 h，使用含有DAPI的防熒光淬滅的封片劑封片，避光靜置數(shù)分鐘，而后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.3 心肌細(xì)胞感染及給藥 提取原代心肌細(xì)胞接種于六孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁48 h后，進(jìn)行感染及給藥實(shí)驗(yàn)。吸棄培養(yǎng)基，加入1/2體積新培養(yǎng)基，加入Ad-GFP-RFP-LC3腺病毒原液(MOI=100，病毒滴度1×1010PFU/mL)，4 h后換全體積培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后給藥處理。氯喹(Chloroquine，CQ，20 μmol/L)預(yù)先刺激30 min后，給予Hcy(500 μmol/L)刺激共孵育，24 h后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.4 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI kit凋亡檢測(cè)

收集細(xì)胞培養(yǎng)基至離心管內(nèi)，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，輕輕吹打后收集細(xì)胞加入到前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，1 000 rpm，5 min離心，吸除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心，小心去除上清，用1×結(jié)合緩沖液(1∶3比例用去離子水稀釋)重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1～5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液于流式Ep管，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488，混勻后室溫避光5 min，加入10 μL 20 μg/mL碘化錠溶液(PI)，最后加入400 μL PBS混勻，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV(+)/PI(-)細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1原代乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定原代乳鼠心肌細(xì)胞貼壁3天后，利用倒置顯微鏡鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動(dòng)情況(圖1A)。采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)心肌細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定(圖1B)。鏡下所見心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好，成簇生長，搏動(dòng)明顯，表明提取細(xì)胞技術(shù)成熟，原代心肌細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Hcy可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡乳鼠心肌細(xì)胞貼壁3 天后，在培養(yǎng)基中加入Hcy(500 μmol/L)與心肌細(xì)胞共同孵育24 h，然后對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV/PI雙標(biāo)記染色，利用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比Hcy處理組AnnexinV(+)/PI(-)細(xì)胞明顯增多(圖2，P<0.05)。

圖1 原代乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定(200×)A:原代心肌細(xì)胞形態(tài)，B：心肌細(xì)胞α-actinin染色

圖2 Hcy可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡與Control 組比較，*P<0.05

2.3 Hcy降低原代心肌細(xì)胞自噬水平乳鼠心肌細(xì)胞貼壁3天后，在培養(yǎng)基中加入梯度濃度的Hcy與心肌細(xì)胞共同孵育24 h，利用wstern blot方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的改變。結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞LC3II/LC3I的比值隨Hcy濃度升高而降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性(圖3A)。為了進(jìn)一步檢測(cè)Hcy對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞自噬流的影響，首先使用溶酶體抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)，防止LC3-Ⅱ蛋白被溶酶體降解，從而使其在胞內(nèi)聚集，而后加入Hcy共同孵育觀察其對(duì)LC3-Ⅱ的作用。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Hcy刺激后，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的熒光點(diǎn)狀聚集明顯減少(圖3B)。

2.4 Hcy可激活mTOR信號(hào)通路為探討Hcy降低心肌細(xì)胞自噬水平的可能機(jī)制，利用western blot方法檢測(cè)自噬的重要調(diào)控通路mTOR及其下游蛋白P70 S6K的磷酸化水平。結(jié)果顯示，Hcy處理可以明顯提高mTOR及其下游蛋白磷酸化水平(圖4)。

圖3 Hcy抑制原代心肌細(xì)胞自噬水平(400×)A：與Control 組比較，#：P<0.05，*P<0.01；B：Ad-GFP-RFP-LC3，激光共聚焦鏡下觀察

圖4 Hcy可激活mTOR信號(hào)通路與Control 組比較，#P<0.05，*P<0.01

3 討 論

大量的臨床試驗(yàn)及流行病學(xué)研究已經(jīng)表明，血漿同型半胱氨酸水平增高是心力衰竭以及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，中國高血壓防治指南將空腹血漿總Hcy水平 > 10 μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥[9]。血漿Hcy水平與發(fā)生心腦血管疾病呈正相關(guān)，Hcy每升高5μmol/L，腦卒中增加59%，而Hcy每降低3 μmol/L，可降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)約24%。但目前對(duì)于高同型半胱氨酸血癥促進(jìn)心力衰竭及心血管損傷的具體機(jī)制尚存在很多疑問。自噬是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種重要機(jī)制，指細(xì)胞將損傷的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解消化，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和相關(guān)細(xì)胞器更新的過程，主要以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征[10]。生理狀態(tài)下自噬水平較低，降解的細(xì)胞內(nèi)成分可以提供營養(yǎng)或原料供給細(xì)胞循環(huán)再利用[11]；病理狀態(tài)下，自噬水平發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)，作為一種適應(yīng)性反應(yīng)以維持細(xì)胞內(nèi)整體的穩(wěn)態(tài)平衡。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞自噬可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。作為調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的兩種重要機(jī)制，自噬與凋亡對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予原代乳鼠心肌細(xì)胞Hcy共孵育刺激，心肌細(xì)胞凋亡率升高的同時(shí)細(xì)胞自噬水平明顯降低。

細(xì)胞自噬水平受一系列信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，其中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR)是自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白。mTOR對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)敏感[13]。在營養(yǎng)豐富的情況下，mTOR受Akt信號(hào)通路磷酸化激活，進(jìn)而抑制自噬水平[14-15]。mTOR的下游信號(hào)通路p70S6K的磷酸化可間接反映mTOR信號(hào)通路的活性[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy在神經(jīng)細(xì)胞可直接激活mTOR信號(hào)通路。本研究利用western blot技術(shù)觀察了心肌細(xì)胞mTOR以及下游p70S6K的磷酸化水平。結(jié)果表明，500 μmol/L Hcy刺激可明顯上調(diào)心肌細(xì)胞mTOR以及下游p70S6K的磷酸化，這提示mTOR信號(hào)通路可能參與了Hcy對(duì)心肌細(xì)胞自噬的抑制作用。但是，結(jié)果中100 μmol/L Hcy刺激后mTOR磷酸化水平只有升高的趨勢(shì)，而其下游p70S6K磷酸化水平升高，可能是因?yàn)閙TOR是289 kD的大分子蛋白，因技術(shù)手法局限沒有檢測(cè)出明顯差異。

綜上，本研究表明高濃度的Hcy促進(jìn)凋亡發(fā)生的同時(shí)可抑制心肌細(xì)胞自噬水平，mTOR信號(hào)通路可能參與其中。本研究為揭示HHcy的心肌損傷機(jī)制提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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