廖 潔，何 潔，莫磊興，王天順，蔣文艷

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】重金屬污染土壤中的污染元素可通過農(nóng)作物根的吸收運(yùn)輸?shù)狡淇墒秤貌糠郑?jīng)過食物鏈傳遞，最終影響人體健康[1-2]。鎘(Cd)并不是植物生命活動(dòng)的必需元素，但容易被植物吸收、運(yùn)輸和累積，其通過傷害光合作用、呼吸作用和營(yíng)養(yǎng)代謝等抑制植物生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植物死亡[3]。重金屬污染下一些氨基酸含量的變化對(duì)植物重金屬抗性有重要生理意義[4]。甘蔗是中國(guó)第一大糖料作物，也是世界上食糖生產(chǎn)的最主要原料，甘蔗對(duì)Cd脅迫具有較強(qiáng)的抗性和積累能力，探討Cd在甘蔗體內(nèi)的蓄積及其對(duì)甘蔗游離氨基酸含量的影響，對(duì)甘蔗耐受 Cd 脅迫機(jī)制及甘蔗進(jìn)行土壤Cd污染修復(fù)提供依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Cd在植物中的吸收和積累會(huì)引起一系列形態(tài)、生理和生物化學(xué)特性的變化[5]，植物在受到重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)能夠合成一系列濃度為毫摩爾級(jí)的代謝物，尤其是氨基酸類物質(zhì)，如脯氨酸(Pro)和組氨酸(His)等，因此，氮代謝是植物對(duì)重金屬脅迫的主要反應(yīng)[6]，而氨基酸的變化情況可以反映出其體內(nèi)氮代謝的情況。楊居榮和蔣婉茹[7]研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下小麥體內(nèi)氨基酸發(fā)生了變化；孫秀梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下擬南芥中檢測(cè)到的大部分氨基酸類化合物發(fā)生變化，李元等[8]通過大田模擬試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Cd污染導(dǎo)致蛋白水解，氨基酸含量增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘蔗耐Cu、Cd及Se等金屬脅迫的能力較強(qiáng)，是一種很有潛力的土壤修復(fù)作物[9]，然而，關(guān)于Cd等重金屬的脅迫對(duì)甘蔗游離氨基酸含量的影響的研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究不同外源高濃度Cd污染下甘蔗體內(nèi)Cd的吸收、游離氨基酸含量的變化及各變化間的相互聯(lián)系，對(duì)Cd的毒理進(jìn)行探討和分析，為進(jìn)一步研究甘蔗Cd脅迫耐受機(jī)制及其對(duì)污染土壤的修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試土壤于2016年3月16日采集于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，pH 5.2，有機(jī)質(zhì)含量 13.0 g/kg，水解性氮 78.4 mg/kg，有效磷 102.0 mg/kg，速效鉀 90.0 mg/kg。供試甘蔗品種為新臺(tái)糖22號(hào)。

1.1.2 儀器設(shè)備 電子天平(A&D Company，Limited)；pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn))；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司產(chǎn))；PinAAcle 900T原子吸收光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn))；S433D氨基酸分析儀(德國(guó)Sykam公司產(chǎn))。

1.2 試驗(yàn)方法

采用桶栽試驗(yàn)(膠桶高34 cm，口徑32 cm，在桶邊開4個(gè)對(duì)稱的排水小孔)，每桶裝磚紅壤土20 kg，重金屬Cd采用氯化鎘[Cd(Cl)2·2.5H2O]添加濃度(以純Cd計(jì))分別為0、25、50和100 mg/ kg，其相對(duì)應(yīng)的處理分別表示為CK(對(duì)照)、Cd 25、Cd 50和Cd 100。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，共計(jì)15桶。甘蔗按常規(guī)方式種植，于2016年4月初將母種甘蔗按芽分節(jié)，每個(gè)蔗節(jié)有一個(gè)芽，每盆種植3個(gè)蔗節(jié)。自處理后，施用復(fù)合肥料5 g，在拔節(jié)期再補(bǔ)施5 g復(fù)合肥，同時(shí)根據(jù)天氣狀況，不定期澆等量的水，為了防止Cd污染物滲漏損失，在盆下放置塑料托盤并將Cd滲漏液倒回盆中。于2017年1月5日收獲。在甘蔗成熟期取植物樣品測(cè)定Cd以及蔗汁游離氨基酸含量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

甘蔗成熟收獲時(shí)，將地上部莖和葉分開收獲，對(duì)于每桶收獲的葉片和部分蔗莖經(jīng)處理用于重金屬Cd的測(cè)定，另一部分蔗莖用于榨汁過濾測(cè)定游離氨基酸。

甘蔗重金屬Cd測(cè)定方法：甘蔗的莖和葉經(jīng)105 ℃殺青，70 ℃下烘干至恒重，測(cè)定各樣品的干重。烘干的樣品粉碎過20目篩，取0.2 g左右的樣品，采用采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.15-2014[10]微波消解法測(cè)定，甘蔗樣品經(jīng)硝酸和過氧化氫消解后利用原子吸收分光光度法測(cè)定甘蔗Cd總量。

游離氨基酸的測(cè)定：用干凈的布將甘蔗表面的灰塵及雜質(zhì)擦掉，壓榨過濾。取1 mL甘蔗汁，加入10 mL 80 %乙醇，混勻，靜置5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，經(jīng)全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)的檢測(cè)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用Excel 2016和SPSS 22.0 進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的運(yùn)算，LSD法顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd污染對(duì)甘蔗生長(zhǎng)的影響

土壤中Cd污染對(duì)蔗芽破土產(chǎn)生了明顯的抑制作用，Cd 100和Cd 25處理的蔗芽破土?xí)r間比對(duì)照晚一些，且其抑制作用隨著土壤中Cd濃度的增加而增大。Cd 25和Cd 50處理的甘蔗生長(zhǎng)正常，葉片保持鮮綠，但是葉尖較對(duì)照稍黃，Cd 100處理生長(zhǎng)受到明顯抑制，蔗苗長(zhǎng)勢(shì)較短小，甘蔗呈現(xiàn)重金屬毒害癥狀，具體表現(xiàn)為葉片黃化、邊緣卷曲、植株矮小和莖節(jié)短小，可見毒害程度隨著莖葉Cd含量增加而加深。

2.2 Cd在甘蔗體內(nèi)各器官中的含量

從表1可知，甘蔗莖和葉的Cd含量隨著土壤中Cd濃度的增加而增加；除了Cd 25 處理下甘蔗葉含量比甘蔗莖略高，其他濃度下甘蔗不同部位Cd含量大小表現(xiàn)為：甘蔗莖>甘蔗葉。3個(gè)施Cd處理的甘蔗莖中Cd的含量顯著高于CK，各處理甘蔗莖和葉中Cd含量的高低順序依次是：Cd 100>Cd 50>Cd 25>CK，隨著Cd濃度的不斷增加，甘蔗植株莖葉的Cd含量均顯著增加，莖葉受到毒害不斷加重，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育。將甘蔗莖及甘蔗葉Cd含量與Cd脅迫濃度做雙變量相關(guān)性分析，它們的相關(guān)系數(shù)分別為0.911**(**代表P<0.01，下同)和0.913**，說明甘蔗莖和葉Cd含量與Cd脅迫濃度均呈極顯著正相關(guān)。

表1不同Cd濃度處理下甘蔗莖和葉Cd含量
Table 1 The Cd content in sugarcane stems and sugarcane leaves under different treatments

Cd處理Cdtreatment甘蔗莖(mg/kg)Sugarcanestems甘蔗葉(mg/kg)Sugarcaneleaves00 067±0 02c0±0 00c252 2±0 44c2 67±0 82b509 6±0 36b6 64±1 52b100103 3±6 7a65 30±4 6a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)。
Note:Data mean ± SD. Different lower case letters in the same column indicate significant at 0.05 level.

2.3 Cd對(duì)甘蔗汁游離氨基酸種類與含量的影響

用氨基酸全自動(dòng)分析儀測(cè)定不同Cd濃度處理下對(duì)常見的17種游離氨基酸的影響，結(jié)果見表2。在對(duì)照處理中，甘蔗汁中17種游離氨基酸的種類齊全，1000 mL蔗汁中含游離氨基酸3480 mg。不同種類氨基酸含量有較大的差異，其中絲氨酸(Ser)含量最高，為2.904 mg/mL，半胱氨酸(Cys)含量最低，為0.004 mg/mL，不同濃度的Cd處理均不改變甘蔗汁中氨基酸的種類組成，但對(duì)其含量產(chǎn)生了影響。

由表2可知，Cd脅迫改變了甘蔗汁中游離氨基酸含量，甘蔗汁游離氨基酸總含量在Cd 25處理下降低，但是隨Cd處理濃度增加而增大，在 Cd 50下比對(duì)照增加了32.50 %，Cd 100處理下，總氨基酸含量顯著增加，比對(duì)照增加了139.20 %。但各種游離氨基酸含量變化的趨勢(shì)存在一定的差異，其中精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)及賴氨酸(Lys)含量隨Cd處理濃度增加而增加，Cd 100處理下顯著增加，增幅分別達(dá)1700.00 %、333.33 %及827.30 %；在 Cd 25處理下，蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)及組氨酸(His)含量有所降低，而后在 Cd 50處理下含量升高，Cd 100時(shí)大部分氨基酸含量顯著增加；丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)及苯丙氨酸(Phe)在 Cd 25和Cd 50脅迫下，氨基酸含量比對(duì)照有所下降，在 Cd 100時(shí)升高；脯氨酸(Pro)含量隨著Cd脅迫濃度的增加而降低，在Cd 100脅迫下有所升高，但是仍比對(duì)照低33.30 %。

3 討 論

(1)Cd脅迫使得甘蔗地上部莖葉的Cd含量顯著增加。本研究在分析Cd脅迫對(duì)甘蔗莖葉的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)甘蔗不同器官受Cd脅迫的影響存在差異，除了Cd濃度為25 mg/kg的處理下甘蔗葉含量比甘蔗莖略高之外，其他濃度處理下甘蔗不同器官Cd含量均表現(xiàn)為甘蔗莖>甘蔗葉，莖部受Cd脅迫影響較大，表明甘蔗不同器官受Cd脅迫影響是存在差異的。

表2 不同Cd處理下甘蔗汁中游離氨基酸的含量Table 2 Content of 17 free amino acids in sugarcane juice in different Cd groups (mg/mL)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)。
Note:Data are mean ± SD. Different lowercase letters in the same line indicate significant at 0.05 level.

(2)本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗中不同種類氨基酸含量有較大差異，其中Ser含量最高，這與黃艷等[11]研究的常見果蔬中游離氨基酸含量的測(cè)定研究中甘蔗汁中Ser含量最高結(jié)果是一致的。不同濃度的Cd處理均不改變甘蔗汁中氨基酸的種類組成，但對(duì)其含量產(chǎn)生了影響。本研究發(fā)現(xiàn)Arg、Leu、Lys、Phe、Asp、Glu、Gly、His、Lie、Met及Cys等氨基酸在Cd脅迫下會(huì)在甘蔗組織中積累。相關(guān)研究表明，植物體內(nèi)游離氨基酸中的羧基、氨基、巰基和酚基等功能團(tuán)能與金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的螯合物，對(duì)有毒重金屬具有鈍化和解毒作用；游離氨基酸中的Pro、Glu和Cys還是植物螯合肽合成前體，而植物螯合肽被認(rèn)為對(duì)植物重金屬耐性起重要作用[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)Pro含量在Cd濃度為25 mg/kg時(shí)先降低，而后隨著脅迫濃度的升高而增加，但是略低于對(duì)照樣品的濃度，這與程旺大等[15]研究發(fā)現(xiàn)幾個(gè)不同品種的水稻Pro受Cd脅迫呈抑制效應(yīng)結(jié)果相近，孫秀梅[6]等研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫濃度為50 mg/kg時(shí)擬南芥Pro比對(duì)照低，當(dāng)脅迫達(dá)到100 mg/kg時(shí)其含量是對(duì)照樣品的1.5倍多，與本研究結(jié)果有相似之處，與張金彪等[16]研究發(fā)現(xiàn)的Cd可引起小草莓體內(nèi)游離Pro累積的結(jié)果不一致。程旺大等[15]研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下水稻籽粒游離氨基酸含量的變化存在較大的基因型差異。結(jié)合前人研究結(jié)果及本研究結(jié)果，作物Pro含量的變化情況可能與作物種類及其基因型差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

Cd脅迫下甘蔗莖葉中的Cd含量顯著增加，其生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響。Cd脅迫可改變甘蔗體內(nèi)游離氨基酸的含量，對(duì)甘蔗氮代謝造成嚴(yán)重影響。

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