韓芬

【摘要】 目的 探究丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸（HCY）誘導(dǎo)增殖血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)基因免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Bip）表達(dá)的影響。方法 通過HCY誘導(dǎo)構(gòu)建兔VSMC增殖模型， 給予瑞舒伐他汀或不同濃度的丹參酮ⅡA進(jìn)行培養(yǎng)， 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定實(shí)驗(yàn)兔Bip mRNA基因表達(dá)。結(jié)果 模型組Bip mRNA表達(dá)（3.27±0.30）高于空白對照組（0.13±0.35）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;丹參酮ⅡA組0.5 mg/L劑量的Bip mRNA表達(dá)（4.53±0.60）、1.0 mg/L劑量的Bip mRNA表達(dá)（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀組Bip mRNA表達(dá)（8.80±0.21）均高于模型組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 丹參酮ⅡA對HCY誘導(dǎo)增殖VSMC ERS相關(guān)基因Bip表達(dá)具有明顯作用。

【關(guān)鍵詞】 丹參酮ⅡA;血管平滑肌細(xì)胞;同型半胱氨酸;免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.116

目前臨床尚未闡述動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生機(jī)制， 但普遍認(rèn)為與血管內(nèi)皮損傷、血小板粘附、纖維組織增生、平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）等因素相關(guān)， 其中動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為VSMC遷移、增殖、攝取低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞[1， 2]。有效干預(yù)VSMC遷移、增殖對動(dòng)脈粥樣硬化程度的降低具有重要的臨床意義。本文對丹參酮ⅡA對VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress， ERS） 相關(guān)基因免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chains binding protein， Bip） 表達(dá)的影響進(jìn)行分析， 旨在探究丹參酮ⅡA對動(dòng)脈粥樣硬化起到的藥理作用， 為丹參酮ⅡA治療心血管疾病的有效性提供依據(jù)， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 細(xì)胞：兔主動(dòng)脈VSMC（中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心）。藥品：丹參酮ⅡA對照品、瑞舒伐他汀、HCY分別來自（中國藥品生物制品鑒定所， 批號(hào)200619 ）、（阿斯利康制藥有限公司， 批號(hào)ER322）、（Sigma公司， 批號(hào)C-7352）。純度均在98%及以上。儀器：7500 Fast Dx 實(shí)時(shí)定量PCR儀、Tgradient PCR 擴(kuò)增儀、IX71-F22FL /PH型倒置相差熒光顯微鏡。試劑：實(shí)時(shí)定量試劑盒與總RNA 提取試劑（日本Takara公司） 。

1. 2 方法 首先制備細(xì)胞懸液， 即丹參酮ⅡA組、空白對照組、模型組、瑞舒伐他汀組， 以1×108/L密度對以上四組細(xì)胞進(jìn)行稀釋， 并接種在96孔培養(yǎng)板實(shí)施培養(yǎng)， 24 h 后分別對其中三組（丹參酮ⅡA組、瑞舒伐他汀組、模型組）加入1×10-4mol/L的HCY， 空白對照組僅加入等體積培養(yǎng)液。24 h后， 瑞舒伐他汀組加入終濃度10 μmol/L瑞舒伐他汀， 同時(shí)丹參酮ⅡA組分別加入終質(zhì)量濃度0.5、1.0 mg/L丹參酮ⅡA， 培養(yǎng)48 h。引物設(shè)計(jì)：β-actin， 上游、下游分別為5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'、5'-AGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3';Bip， 上游、下游分別為 5-TCT AGGTGAACGACCCCTAAC-3、5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3。從以上述每組提取細(xì)胞總RNA， 以逆轉(zhuǎn)錄方式合成cDNA。PCR反應(yīng)體系、SYBR Green I Mixture分別為10、5 μl， 上下游引物均為0.25 μl， 模板cDNA、ddH2O、Rox分別為1、3.3、0.2 mol/L。反應(yīng)條件如下： 95℃預(yù)變性10 min、95℃變性30 s、58℃退火與72℃延伸均為40 s， 總共45個(gè)循環(huán)， 各個(gè)樣本RNA含量均依照各自β-actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 利用2-△△CT 法對Bip基因相對表達(dá)予以分析。

1. 3 觀察指標(biāo) 分析丹參酮ⅡA對VSMC ERS相關(guān)基因Bip表達(dá)的影響。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差 （ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組Bip mRNA表達(dá)（3.27±0.30）高于空白對照組（0.13±0.35）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;丹參酮ⅡA組0.5 mg/L劑量的Bip mRNA表達(dá)（4.53±0.60）、1.0 mg/L劑量的Bip mRNA表達(dá)（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀組Bip mRNA表達(dá)（8.80±0.21）均高于模型組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

隨著大量臨床實(shí)踐研究的深入， 認(rèn)定動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管壁炎癥反應(yīng)、VSMC增生與遷移等， 同時(shí)已證實(shí)血管壁組成細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分間的相互作用是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變形成、VSMC增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-5]。加強(qiáng)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制VSMC過度增殖為當(dāng)前預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的有效途徑。

HCY屬于一個(gè)代謝中間產(chǎn)物， 已證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子， 決定著動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度[7]。研究發(fā)現(xiàn)， HCY對體外培養(yǎng)VSMC、動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)VSMC均起到促進(jìn)增殖作用， 說明通過HCY誘導(dǎo)VSMC增殖會(huì)誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。而ERS指各種應(yīng)激原通過誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)堆積而激活未折疊蛋白反應(yīng)（ unfolded protein response， UPR）、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。結(jié)果得出， HCY促進(jìn)VSMC增殖的同時(shí)ERS相關(guān)基因表達(dá)量上升， 考慮HCY促進(jìn)VSMC過度增殖過程中可能存在ERS的參與。

丹參化學(xué)成分分為分水溶性、脂溶性， 其中丹參酮ⅡA屬于脂溶性， 具有舒張血管、降壓、抗栓等作用， 常被臨床用于治療心血管疾病[8]。本文結(jié)果表明， 丹參酮ⅡA可有效通過抑制分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路而阻斷VSMC DNA的合成、異常增殖等， 加上丹參酮ⅡA對CyclinD1、CDK4的表達(dá)具有良好的干預(yù)效果。丹參酮ⅡA有助于拮抗HCY 誘導(dǎo)VSMC 增殖， 充分體現(xiàn)出丹參酮ⅡA抗VSMC 增殖功效與其自身劑量存在密切聯(lián)系， 加之丹參酮ⅡA組Bip基因高表達(dá)， 進(jìn)一步表明ERS是抗動(dòng)脈粥樣硬化的一種重要機(jī)制[9， 10]。

綜上所述， 丹參酮ⅡA對HCY誘導(dǎo)增殖VSMC ERS相關(guān)基因Bip表達(dá)的具有顯著作用， 適用于動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病的治療。

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[收稿日期：2017-11-07]