姚 博，贠建民*，艾對(duì)元，嚴(yán)海嬌，白 杰，李多佳

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

漿水是我國(guó)西北地區(qū)一種傳統(tǒng)發(fā)酵酸性調(diào)味食品，一般是用經(jīng)焯水后的蔬菜加入面湯或米湯經(jīng)微生物發(fā)酵制成[1]。其湯汁略呈乳白色，口味酸醇清香，含有豐富的益生菌群[2]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有清熱解暑、開胃止渴、調(diào)理臟腑和降血壓等功效[3-4]，長(zhǎng)期以來(lái)深受西北人民青睞。

自然發(fā)酵漿水中微生物菌系復(fù)雜，其中優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌和酵母菌，賦予了漿水良好的風(fēng)味[5]。相較于工業(yè)化純種發(fā)酵而言，傳統(tǒng)多菌種混合發(fā)酵工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品味道更優(yōu)、風(fēng)味更濃，但傳統(tǒng)發(fā)酵過程因受原料、地域、生產(chǎn)規(guī)模和方法等因素的影響，致使?jié){水的風(fēng)味品質(zhì)差異較大，且發(fā)酵后期易受霉菌污染[6]，不便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)安全、衛(wèi)生、健康的漿水工業(yè)化產(chǎn)品，是人們的迫切需要。

直投式發(fā)酵菌劑是傳統(tǒng)發(fā)酵食品實(shí)現(xiàn)工藝現(xiàn)代化改造過程的關(guān)鍵[7]，而篩選獲得產(chǎn)香性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株是開發(fā)直投式發(fā)酵菌劑的基礎(chǔ)。目前，漿水的研究主要集中在漿水發(fā)酵工藝研究[8-9]、微生物的分離鑒定[5-6]及其亞硝酸鹽的變化[3,10]等方面，對(duì)于漿水中優(yōu)良功能菌株的篩選研究報(bào)道甚少。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室多年的研究，漿水中的特征香氣成分為檸檬烯、乙酸乙酯、乙醛、蒎烯、苯乙醇、正己醇和乙酸，這些香氣物質(zhì)主要來(lái)自于發(fā)酵過程微生物的代謝作用[11]。為此，本研究擬通過篩選漿水中產(chǎn)香性能優(yōu)良的酵母菌菌株，并優(yōu)化其增殖培養(yǎng)基，旨在為開發(fā)漿水輔助發(fā)酵直投式菌劑及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供產(chǎn)香菌種來(lái)源和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

漿水由甘肅天水孟姑漿水廠提供。

環(huán)己酮（色譜純） 美國(guó)Sigma Aldrich公司；酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酵母菌分離培養(yǎng)基（yeast extract-peptone-dextrose，YEPD）：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母菌液體培養(yǎng)基（yeast extract-peptone-dextrose broth，YPB）：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

豆芽汁培養(yǎng)基：豆芽汁（10%）100 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基：將大麥芽粉碎，麥芽粉與水的比例為1∶4（g/mL），38 ℃保溫2 h，升溫至45 ℃，30 min，再提高到50℃，30 min，再升華至60 ℃，糖化1～1.5 h至完全糖化，并用雞蛋清煮沸澄清，稀釋至適當(dāng)濃度，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母膏1g，蒸餾水1000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；101-1-S-II電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；TRACE 1310氣相色譜儀、TG-WAX色譜柱 美國(guó)Thermo Scientific公司；頂空固相微萃取裝置（DVB/CAR/PDMS萃取器） 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母菌菌株的篩選

1.3.1.1 酵母菌菌株的分離

吸取10 mL漿水于已滅菌的裝有90 mL無(wú)菌生理鹽水的500 mL三角瓶中，充分搖勻，制備菌懸液，梯度稀釋至10-7，吸取稀釋液0.1 mL均勻涂布在已滅菌的YEPD固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。取菌落密度適中的平板，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進(jìn)行劃線分離[12]。

1.3.1.2 產(chǎn)香酵母菌菌株的篩選

分別挑取1環(huán)純化后的酵母菌菌種接種于50 mL/150 mL 10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1～5 d。

由10 位身體健康，無(wú)不良嗜好、偏食和變態(tài)性反應(yīng)的同學(xué)組成評(píng)價(jià)小組，對(duì)發(fā)酵后的酵母菌培養(yǎng)液持續(xù)每日進(jìn)行外觀及氣味的評(píng)價(jià)，綜合評(píng)價(jià)，挑選出產(chǎn)香氣良好、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)不良?xì)馕兜膸字杲湍妇闧13]。同時(shí)對(duì)其發(fā)酵殘?zhí)橇俊⑸锪亢蛽]發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定優(yōu)選產(chǎn)香酵母菌。

1.3.2 發(fā)酵性能檢測(cè)

殘?zhí)橇繙y(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸法[14]。生物量測(cè)定：采用質(zhì)量恒定法[15]。產(chǎn)香性能測(cè)定：采用半定量頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solidphase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HSME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)酵母菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性成分測(cè)定，以滅菌后不接菌培養(yǎng)基在同等條件培養(yǎng)后作為對(duì)照。

萃取條件：在裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入10 mL發(fā)酵液，并加入1 g NaCl和16 μL/mL的10 μL環(huán)己酮，40 ℃恒溫?cái)嚢?0 min，將已老化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，吸附30 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸10 min。

GC條件：TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣，流量1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至180 ℃，保留10 min。

MS條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍50～450 u。經(jīng)計(jì)算機(jī)在Nist及Wiley標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索對(duì)比，通過計(jì)算機(jī)相應(yīng)的保留指數(shù)對(duì)比，匹配度大于700（最大值為1 000）進(jìn)行確認(rèn)。

內(nèi)標(biāo)法[16]（假定各組分的響應(yīng)因子為1）計(jì)算公式為：mi=（ms/As）×Ai。其中mi為組分的質(zhì)量；ms為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Ai為組分的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

根據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊(cè)》[17]，對(duì)該菌株進(jìn)行菌體形態(tài)，包括子囊孢子、擲孢子、假菌絲的觀察，及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、類淀粉化合物生成、硝酸鹽利用、脲酶實(shí)驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.3.3.2 分子生物學(xué)序列鑒定

將提取的基因組DNA委托北京奧維森生物科技有限公司對(duì)26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因進(jìn)行序列擴(kuò)增。得到的26S rDNA D1/D2區(qū)序列結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，所得基因序列通過BLAST程序提交，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列檢索，將目標(biāo)菌株和應(yīng)用BLAST檢索到的與之較高的同源性菌株的26S rDNA中D1/D2區(qū)域基因序列作最大同源性比較分析[18]。

1.3.4 酵母菌菌株增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.4.1 增殖基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

挑取1 環(huán)斜面活化的酵母菌接種到10 mL YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，制成酵母富集液，用無(wú)菌水稀釋至約10-5的菌懸液，4 ℃保藏備用。

分別配制10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、YPB培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種3%菌懸液于各培養(yǎng)基（30 mL/150 mL）中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定各培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度。分別配制4、6、8、10、12、14 °Be′的麥芽汁培養(yǎng)基，同上述條件，測(cè)定各培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度。細(xì)胞濃度測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法[19]。

1.3.4.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

吸取3%的菌懸液接種于30 mL/150 mL的麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定細(xì)胞濃度[20]。

1.3.4.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

在裝液量30 mL/150 mL、接種量3%、28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)20 h后，以發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度為優(yōu)選指標(biāo)，對(duì)麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

以篩選出的麥芽汁培養(yǎng)基為對(duì)照，在其基礎(chǔ)上添加10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉篩選最佳碳源；添加5、10、20、30、40、50 g/L的葡萄糖篩選最適糖質(zhì)量濃度；在最佳碳源的基礎(chǔ)上添加0.5 g/L氮元素的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素、硝酸鉀篩選最佳氮源；添加1、2、3、4、5、6 g/L的牛肉膏篩選最適氮源質(zhì)量濃度；在最佳碳源和氮源基礎(chǔ)上，添加0.5 g/L的KH2PO4、NaCl、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CaCl2篩選最佳無(wú)機(jī)鹽種類，添加0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g/L的KH2PO4篩選最適無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度[21]。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、牛肉膏、KH2PO4質(zhì)量濃度為考察因素，使用Design-Expert對(duì)各因素進(jìn)行中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以細(xì)胞濃度為響應(yīng)值，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)基組合。

1.3.4.4 Y16菌株在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基中產(chǎn)香能力的GC-MS檢測(cè)

為進(jìn)一步檢驗(yàn)優(yōu)選菌株增殖后的產(chǎn)香能力，采用同1.3.2節(jié)方法，對(duì)其在最佳增殖培養(yǎng)基上發(fā)酵后的乙酸乙酯及檸檬烯含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

2.1.1 感官評(píng)定結(jié)果

從漿水中分離篩選出16 株酵母菌，編號(hào)為Y1～Y16，分別接種于10 °Be′麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1～5 d。發(fā)酵期間對(duì)酵母菌發(fā)酵液持續(xù)每日進(jìn)行外觀及氣味的評(píng)價(jià)，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。

由表1可以看出，分離出的16 株酵母菌發(fā)酵液的感官風(fēng)味特征各異，其中Y3、Y5、Y12、Y15和Y16共5 株酵母菌菌株不產(chǎn)生褐變，產(chǎn)果香持久、濃郁，風(fēng)味良好；Y2、Y4、Y7、Y9、Y10和Y11共6 株酵母菌產(chǎn)生較淡的果香味，無(wú)明顯異味，其中Y9發(fā)酵第3天后發(fā)生褐變；Y6、Y13發(fā)酵前期產(chǎn)生香味，第3天后出現(xiàn)不良風(fēng)味；Y1發(fā)酵過程中出現(xiàn)不良風(fēng)味；Y8發(fā)酵中輕微褐變，香味不突出；Y14發(fā)酵中無(wú)褐變，無(wú)明顯香味和異味。綜上，Y3、Y5、Y12、Y15和Y16共5 株酵母菌株產(chǎn)香味持久濃郁，產(chǎn)香性能突出，發(fā)酵過程中無(wú)不良風(fēng)味，故選作產(chǎn)香初篩菌株。

2.1.2 5 株初篩酵母菌發(fā)酵過程殘?zhí)橇考吧锪孔兓?/p>

圖1 發(fā)酵過程中5 株酵母菌殘?zhí)橇康淖兓疐ig. 1 Change in residual sugar during fermentation of 5 selected yeasts

圖2 發(fā)酵過程中5 株酵母菌生物量的變化Fig. 2 Change in biomass during fermentation of 5 selected yeasts

酵母菌利用糖的能力越高，其生長(zhǎng)活力旺盛，發(fā)酵性能、物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力就越強(qiáng)。其產(chǎn)生的相應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)也就越多。由圖1可看出，Y5、Y12、Y15和Y16菌株隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，殘?zhí)橇恐鸩浇档?，且降低程度較快，說(shuō)明對(duì)糖的利用速率較快，發(fā)酵能力較好，而Y3菌株發(fā)酵能力相對(duì)較弱。由圖2可看出，5 株酵母菌的生物量增速均較快，在24 h后基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，其中Y12和Y16菌株的生物量最高。

2.1.3 5 株酵母菌發(fā)酵過程產(chǎn)揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果

圖3 5 株酵母菌菌株的GC-MS總離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of GC-MS for volatile compounds produced by five yeasts

由圖3可以得出，初篩的5 株酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物中均含有較高的漿水主體香氣物質(zhì)乙酸乙酯（出峰時(shí)間6.4 min），其中Y12菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量最高，為226.76 μg/mL，Y16菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量次之，為204.45 μg/mL，且該菌株產(chǎn)檸檬烯（出峰時(shí)間14.07 min）的含量也達(dá)到0.063 μg/mL。由于檸檬烯和乙酸乙酯是漿水中最主要的兩種主體風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)漿水風(fēng)味貢獻(xiàn)率最大[11]，故Y16菌株的發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味更接近于傳統(tǒng)自然發(fā)酵漿水特有的風(fēng)味。

鑒于Y16酵母菌菌株的糖利用速率快、菌體生物量高，且其發(fā)酵產(chǎn)物中含有較高的漿水中的主體風(fēng)味檸檬烯和乙酸乙酯，故確定Y16酵母菌菌株為漿水發(fā)酵的優(yōu)良產(chǎn)香菌株。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果

固體培養(yǎng)特征：菌落小，灰白色，圓屋頂狀，半透明，表面平滑，邊緣整齊，黏稠。

液體培養(yǎng)特征：澄清，后期有白色沉淀，有菌璞。

根據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊(cè)》，對(duì)Y16酵母菌菌株進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果如表2所示。通過對(duì)比，該菌株與異常漢遜酵母菌（Hansenula anomala）很相似。

表2 Y16菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Y16

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)篩出的Y16菌株進(jìn)行26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因序列分析鑒定，取其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 Y16菌株的PCR電泳圖Fig. 4 Electrophoregram of PCR amplified genomic DNA from strain Y16

Y16酵母菌26S rDNA中的D1/D2區(qū)域基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在500～600 bp之間，結(jié)果提交GenBank，得知該條帶大小為590 bp（登錄號(hào)FJ972217），提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，與Wickerhamomyces anomalus同源性為99.9%，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征鑒定，確定Y16為異常漢遜酵母。

2.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

圖5 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 5 Effect of different basic media on on the growth of Y16

圖6 麥芽汁培養(yǎng)基濃度對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of wort medium the growth of Y16

由圖5可知，Y16菌株均能利用麥芽汁、豆芽汁、YPB、PDB培養(yǎng)基生長(zhǎng)，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基麥芽汁的細(xì)胞增殖效果最好，細(xì)胞濃度達(dá)到1.99×108個(gè)/mL，因此選擇麥芽汁培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。由圖6可知，隨著麥芽汁濃度的增大，細(xì)胞濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明麥芽汁濃度過高，會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，故選擇10 °Be′的麥芽汁培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.3.2 Y16菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

圖7 Y16菌株生長(zhǎng)曲線Fig. 7 The growth curve of Y16 strain

由圖7可知，Y16菌株在培養(yǎng)6 h后，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期；20 h進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞濃度達(dá)到最大。為使菌體的總生長(zhǎng)量和活性達(dá)到最大，故選擇20 h時(shí)間點(diǎn)作為菌體收集點(diǎn)。

2.3.3 Y16菌株增殖培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.3.3.1 碳源種類及碳源質(zhì)量濃度對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度的影響

圖8 碳源種類對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effect of different carbon sources on the growth of Y16

圖9 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 9 Effect of different glucose concentrations on the growth of Y16

碳源是化能異養(yǎng)型微生物代謝所需的能量來(lái)源，選擇適合的碳源對(duì)提高微生物的繁殖速度和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是非常關(guān)鍵的[22]。乙酰輔酶A是酵母菌體內(nèi)合成檸檬烯及乙酸乙酯的起點(diǎn)[23-24]，而乙酰輔酶A可由葡萄糖降解而來(lái)，所以增加適量的糖有助于提高乙酸乙酯和檸檬烯的含量。由圖8可知，Y16菌株均能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，其中利用葡萄糖細(xì)胞濃度增長(zhǎng)最快。由圖9可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)，Y16菌株生長(zhǎng)越緩慢，說(shuō)明高質(zhì)量濃度的糖不利于微生物生長(zhǎng)，添加葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大，為3.743×108個(gè)/mL，故選擇添加10 g/L的葡萄糖作為補(bǔ)充碳源。

2.3.3.2 氮源種類及氮源質(zhì)量濃度對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度的影響

氮是組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，微生物提供合成細(xì)胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料[25]，微生物在含有有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞濃度增長(zhǎng)速度快，并有利于積累代謝產(chǎn)物。由圖10可知，增加供試的6種氮源均有利于Y16菌株的生長(zhǎng)，其中利用牛肉膏生長(zhǎng)繁殖最快。由圖11可知，添加牛肉膏質(zhì)量濃度在2 g/L時(shí)，最有利于Y16菌株的生長(zhǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)到6.783×108個(gè)/mL，故選擇2 g/L的牛肉膏作為補(bǔ)充氮源。

圖10 氮源種類對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 10 Effect of different nitrogen sources on the growth of Y16

圖11 牛肉膏質(zhì)量濃度對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 11 Effect of different beef extract concentrations on the growth of Y16

2.3.3.3 無(wú)機(jī)鹽種類及KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度的影響

圖12 無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 12 Effect of different salt species on the growth of Y16

圖13 KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)Y16生長(zhǎng)的影響Fig. 13 Effect of different KH2PO4 concentrations on the growth of Y16

由圖12可知，供試的6 種無(wú)機(jī)鹽均有利于Y16菌株的生長(zhǎng)，其中KH2PO4最有利于Y16菌株細(xì)胞濃度的增長(zhǎng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，磷酸鹽對(duì)酵母的生長(zhǎng)及代謝均極為重要，培養(yǎng)基中添加一定量的磷酸鹽，對(duì)產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯有利[26]。由圖13可知，在KH2PO4質(zhì)量濃度為0.7 g/L時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大，為8.017×108個(gè)/mL，故選擇0.7 g/L的KH2PO4作為補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽。

2.3.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在10 °Be′麥芽汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖10 g/L、牛肉膏2 g/L、KH2PO40.7 g/L，細(xì)胞濃度具有最大值。因此使用Design-Expert對(duì)培養(yǎng)基條件進(jìn)行中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)分析，以細(xì)胞濃度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)及優(yōu)化結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental design with response variable for response surface analysis

經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合，得到培養(yǎng)液中以細(xì)胞濃度為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=8.661 734+0.358 664A+0.388 513B+0.344 273C-0.590 5AB+0.36AC+0.580 5BC-0.824 556A2-0.923 555B2-0.700 816C2

表4 響應(yīng)面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基回歸模型參數(shù)檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

根據(jù)表4方差分析可看出，該模型優(yōu)化Y16菌株培養(yǎng)基在α為0.01的水平上效果顯著，回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），其決定系數(shù)R2為0.961 2，表明該擬合方程與實(shí)際相符，誤差較小，能較好地反映各因素與響應(yīng)值的之間的關(guān)系，可以確定其培養(yǎng)基優(yōu)化配方。其中，A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2因素對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度的影響極顯著（P＜0.01），AC因素對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度增長(zhǎng)的影響顯著（P＜0.05）。由各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度F值可以看出，牛肉膏對(duì)該菌株的細(xì)胞濃度增長(zhǎng)影響最大，葡萄糖的影響次之，KH2PO4的影響最小。

由圖14a可知，響應(yīng)面曲面坡度陡峭且等高線扁而密集，說(shuō)明添加的葡萄糖和牛肉膏兩因素交互作用對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度有極顯著影響；由圖14b可知，響應(yīng)面曲面坡度陡峭度降低，等高線較密集，說(shuō)明添加的葡萄糖與KH2PO4兩因素的交互作用對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度影響顯著；由圖14c可知，響應(yīng)面曲面坡度陡峭，等高線密集，說(shuō)明添加的牛肉膏與KH2PO4兩因素的交互作用對(duì)Y16菌株細(xì)胞濃度影響極顯著。

2.3.3.5 最優(yōu)培養(yǎng)基配方確定及驗(yàn)證

通過對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到Y(jié)16菌株在10 °Be’麥芽汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基上最佳的營(yíng)養(yǎng)物添加量為葡萄糖11.05 g/L、牛肉膏2.27 g/L、KH2PO40.782 g/L，細(xì)胞濃度達(dá)到8.82×108個(gè)/mL。但為提高實(shí)際可操作性，根據(jù)以上響應(yīng)面優(yōu)化Y16菌株增殖培養(yǎng)基結(jié)果，優(yōu)化最佳的營(yíng)養(yǎng)物添加量為葡萄糖11.0 g/L、牛肉膏2.3 g/L、KH2PO40.8 g/L，得到細(xì)胞濃度為8.8×108個(gè)/mL。在此添加量培養(yǎng)基的條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，得到細(xì)胞濃度為8.75×108個(gè)/mL，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.57%。說(shuō)明該模型設(shè)計(jì)準(zhǔn)確可靠，得到的最佳添加量可行，在實(shí)際操作中具有指導(dǎo)意義。

2.4 Y16菌株在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基中產(chǎn)香能力的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

表5 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化前后乙酸乙酯與檸檬烯產(chǎn)量的變化Table 5 Comparative production of ethyl acetate and limonene in optimized and initial medium

由表5可知，對(duì)Y16菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)后，乙酸乙酯的產(chǎn)量同比發(fā)酵初始培養(yǎng)基增加了25.39%，檸檬烯增加了31.75%，增香效果顯著。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品獨(dú)特風(fēng)味形成都與產(chǎn)香功能菌的代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[27]。如Jung等[28]研究泡菜發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)Leuconostoc mesenteroides是主要功能乳酸菌，將其應(yīng)用于發(fā)酵可以很好地改善產(chǎn)品的風(fēng)味。Jansen等[29]發(fā)現(xiàn)魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）在醬油發(fā)酵前期生長(zhǎng)繁殖，其發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等成分生成乙醇、甘油、琥珀酸及其他微量成分，并與嗜鹽片球菌聯(lián)合作用生成糠醇，使醬油具有特殊的香氣。Viana等[30]研究非釀酒酵母在釀造過程中能夠產(chǎn)生特殊的酯香味物質(zhì)或產(chǎn)生不同的高級(jí)醇，形成黃酒的特殊風(fēng)味?？梢姽δ芫Y選對(duì)研究食品風(fēng)味具有重要意義，而目前針對(duì)漿水中具有產(chǎn)香功能菌的菌株研究甚少。

酵母菌活動(dòng)生成乙醇，經(jīng)酯化反應(yīng)生成酯類、醇類、醛類等芳香物質(zhì)，這些物質(zhì)構(gòu)成發(fā)酵食品的特征風(fēng)味成分[31]。Ciani等[32]研究釀酒酵母在15 ℃采用順序發(fā)酵的方法獲得乙酸乙酯的高產(chǎn)量，乙酸乙酯是由酵母菌代謝產(chǎn)生，本研究也得到相似的結(jié)果，異常漢遜酵母能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的乙酸乙酯。

本研究以甘肅傳統(tǒng)釀制的漿水為材料，采用經(jīng)典平板分離法分離出了16 株酵母菌菌株，篩選出一株產(chǎn)香性能優(yōu)良的酵母菌菌株，經(jīng)鑒定為異常漢遜酵母。優(yōu)化得到該菌株的增殖培養(yǎng)基配方為：10 °Be′麥芽汁，其中最佳的營(yíng)養(yǎng)物添加量分別為葡萄糖11.0 g/L、牛肉膏2.3 g/L、KH2PO40.8 g/L，細(xì)胞濃度可達(dá)到8.75×108個(gè)/mL，是初始麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基細(xì)胞濃度的4 倍多。同時(shí)該菌株可以生成乙酸乙酯和檸檬烯這兩種漿水傳統(tǒng)釀制中的特征風(fēng)味物質(zhì)，其中，乙酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到256.35 μg/mL，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基增加了25.39%；檸檬烯的產(chǎn)量達(dá)到0.083 μg/mL，比優(yōu)化前增加了31.75%，增香效果明顯。所以對(duì)該菌株的開發(fā)利用是非常必要的，可為漿水發(fā)酵直投式增香菌劑的開發(fā)提供菌株來(lái)源和技術(shù)參考。

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