李 楊，孫紅波，董濟(jì)萱，劉英杰，畢 爽，張巧智，江連洲，隋曉楠*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是目前研究報(bào)道中唯一含有9 種必需氨基酸且含量滿(mǎn)足人體需求的植物蛋白，是一種公認(rèn)的全價(jià)蛋白質(zhì)[1-2]，由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與優(yōu)良的功能特性，大豆分離蛋白被廣泛地應(yīng)用于乳化劑、起泡劑等不同食品加工領(lǐng)域中。為拓寬其應(yīng)用前景與開(kāi)發(fā)價(jià)值，大豆分離蛋白的天然改性目前已經(jīng)成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)[3-4]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類(lèi)植物色素，由于其具有抗氧化、抗炎等多種性質(zhì)，有助于預(yù)防心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題等疾病[5-6]。由于花青素是一種天然小分子活性化合物，可以將其引入蛋白質(zhì)中發(fā)生相互作用，形成具有重要功能性質(zhì)的復(fù)合體系，進(jìn)而影響蛋白物化功能[7]。事實(shí)上，在食品加工、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)中，蛋白質(zhì)等生物大分子都不可避免的受到來(lái)自這類(lèi)小分子物質(zhì)的影響。蛋白可與多酚發(fā)生相互作用，其結(jié)合方式主要為共價(jià)/非共價(jià)結(jié)合。非共價(jià)作用主要包括疏水相互作用，范德華力和氫鍵等這些相對(duì)較弱的作用類(lèi)型[8-9]。酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白之間的共價(jià)作用主要是在堿性條件下，通過(guò)酚類(lèi)化合物的氧化形成相應(yīng)的醌類(lèi)[10]，這種醌類(lèi)會(huì)進(jìn)一步與蛋白質(zhì)鏈中的氨基酸殘基反應(yīng)[11]。目前已有文獻(xiàn)對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用體系進(jìn)行了部分研究，但未能清晰地解釋復(fù)合體系結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)之間的變化規(guī)律。多酚與蛋白質(zhì)的非共價(jià)作用有助于不同的生物活性，并改變蛋白的界面性質(zhì)與起泡穩(wěn)定性[12-13]。Jia Zhenbao等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白可以在堿性條件下與兒茶素共價(jià)交聯(lián)，酚類(lèi)基團(tuán)可以引起蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并改善蛋白起泡和乳化性能。張冬[15]探究了矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷與牛血清白蛋白相互作用的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)這種類(lèi)黃酮物質(zhì)易被蛋白“綁定”，從而提高植物蛋白的生理活性。茶多酚與大豆分離蛋白之間較強(qiáng)的相互作用會(huì)引起大豆分離蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[16]。然而，針對(duì)大豆蛋白與花青素相互作用對(duì)其功能特性的影響尚不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究對(duì)比花青素與大豆分離蛋白經(jīng)非共價(jià)結(jié)合/共價(jià)交聯(lián)機(jī)制對(duì)其復(fù)合體系功能特性的影響，從而最大限度地發(fā)揮復(fù)合體系中大豆分離蛋白的功能特性。本實(shí)驗(yàn)采用2 種作用條件使大豆分離蛋白與花青素復(fù)合對(duì)起泡及乳化特性進(jìn)行對(duì)比分析，對(duì)大豆蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白由實(shí)驗(yàn)室自制；葵花油 市購(gòu)；花青素黑米提取物 山西太極唐代科技有限公司；大豆哈爾濱高科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠；正己烷（分析純） 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇金城國(guó)勝儀器廠；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；BX41正置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；E2695高效液相色譜 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考Speroni等[17]的制備方法。將脫脂豆粕分散在去離子水中（1∶10，m/m），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8，經(jīng)攪拌2 h后，將懸浮液9 500×g離心30 min，取其上清液用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗3 次后，經(jīng)6 500×g離心30 min，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至蛋白溶液中性即可，將此蛋白溶液凍干并研磨，即可獲得大豆分離蛋白。

1.3.2 花青素的純化與定量

根據(jù)Sui Xiaonan等[18]的方法進(jìn)行花青素的純化。首先將黑米提取物溶解在蒸餾水中，抽濾除去溶液中的不溶性雜質(zhì)。隨后將溶液通過(guò)固相萃取使花青素溶液被完全吸附，分別用2 個(gè)柱體積酸化水和2 個(gè)柱體積的乙酸乙酯去除糖、酸和多酚類(lèi)化合物（如酚酸和黃酮），然后用酸化的甲醇洗脫吸附柱從而獲得花青素溶液。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶液中的甲醇，即可得到純化的花青素提取物。利用高效液相色譜法測(cè)定花青素的含量[19]，將純化的花青素提取物過(guò)0.45 μm濾膜使用C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行高效液相色譜分析，流量為1 mL/min，溫度為25 ℃，梯度洗脫程序參考Sadilova等[20]的方法測(cè)定花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%（為方便計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用黑米中含量較多的矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量為花青素的相對(duì)分子質(zhì)量近似處理）。

1.3.3 樣品的配制

參考Nagy等[9]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末完全溶解于磷酸鹽緩沖液中（10 μm，pH 7.4）配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，將花青素質(zhì)量濃度（0.5、1、2 mg/mL）按比例分別溶于蛋白溶液在室溫條件下混合絕氧攪拌2 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物。參考Kroll等[21]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末完全溶解于磷酸鹽緩沖液中（10 μm，pH 7.4）配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，用0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，將花青素質(zhì)量濃度（0.5、1、2 mg/mL）按比例分別溶于蛋白溶液在室溫條件下混合攪拌24 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素共價(jià)交聯(lián)復(fù)合物。其中，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白溶液作為空白對(duì)照，各樣品處理?xiàng)l件見(jiàn)表1。

表1 花青素與大豆分離蛋白復(fù)合物Table 1 SPI and anthocyanin complexes

1.3.4 起泡性及起泡穩(wěn)定性

參照Aewsiri等[22]的方法測(cè)定起泡性能并稍作修改。樣品依次用高速均質(zhì)機(jī)以17 500 r/min連續(xù)均質(zhì)3 次，每次30 s，將泡沫迅速轉(zhuǎn)入量筒中記錄初始泡沫體積，在室溫條件下靜止10、20、30 min后記錄其泡沫體積。其中所有實(shí)驗(yàn)平均測(cè)量3 次。其起泡特性和起泡穩(wěn)定性按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：V為均質(zhì)前溶液體積/mL；V0為均質(zhì)后初始泡沫體積/mL；Vt為靜止10、20、30 min后泡沫體積/mL。

1.3.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性

參考Pearce等[23]的方法稍作修改。將上述樣品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)?0 mmol/L，pH 7.0）至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，將稀釋的樣品以3∶1（V/V）溶解于葵花油中，使用高剪切均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)1 min形成乳狀液，立即從其乳狀液底部提取50 μL的乳液分散于0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋至100 倍。經(jīng)旋渦振蕩后用分光光度法在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定樣品的吸光度A500nm，用相同濃度十二烷基硫酸鈉溶液作為空白對(duì)照。經(jīng)10 min后再次測(cè)量其吸光度。其中所有實(shí)驗(yàn)平均測(cè)量3 次。

乳化特性和乳化穩(wěn)定性按公式（3）和（4）計(jì)算：

式中：DF為稀釋倍數(shù)（100）；θ為油相體積分?jǐn)?shù)（1/4）；L為比色杯厚度（1 cm）；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（10 g/mL）；A0、A10為乳狀液在0、10 min的吸光度；T10-T0＝10 min。

1.3.6 正置顯微鏡觀察

樣品乳液制備后，用膠頭滴管吸取一滴新鮮復(fù)合乳液樣品，置于顯微鏡載物臺(tái)上，將載玻片用乙醇浸泡后固定樣品，在100 倍正置光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，用CCD照相機(jī)截取圖像，利用電腦數(shù)字圖像軟件處理圖片。

1.3.7 巰基含量的測(cè)量

根據(jù)Ellman等[24]的方法稍做改動(dòng)。在0.5 mL的樣品溶液中加入2.5 mL含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液和0.02 mL含有1% 5,5’-二硫雙-2-硝基苯甲酸的Tris-甘氨酸緩沖液，將其置于40 ℃水浴中保溫25 min。利用雙光束分光光度計(jì)在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對(duì)照。參考文獻(xiàn)[25]計(jì)算巰基含量。

1.3.8 三維熒光光譜分析

大豆分離蛋白與花青素之間的相互作用利用三維熒光光譜測(cè)定，參照Z(yǔ)hang Yezhong等[26]的方法，將樣品分別稀釋50 倍，使蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取稀釋樣品分別置于石英比色皿中測(cè)定。其中，三維熒光光譜的連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長(zhǎng)（λEm）為200～500 nm，起始激發(fā)波長(zhǎng)（λEx）為200 nm，增長(zhǎng)間隔為10 nm，掃描16 條曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，其中P值小于0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 起泡特性與起泡穩(wěn)定性

圖1 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對(duì)蛋白起泡特性與起泡穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effects of anthocyanin binding to SPI on its foam expansion and foam stability

蛋白質(zhì)溶液經(jīng)快速打攪使大量氣體進(jìn)入溶液中，降低其表面張力后形成泡沫的能力稱(chēng)作蛋白的起泡性[27]。如圖1所示，花青素的加入，對(duì)其起泡性和起泡穩(wěn)定性都發(fā)生了顯著的影響。未加入花青素的蛋白溶液其起泡特性和起泡穩(wěn)定性較低，在非共價(jià)結(jié)合（pH 7.4、2 h）和共價(jià)交聯(lián)（pH 9.0、24 h）處理?xiàng)l件下，隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，復(fù)合液中蛋白的起泡特性和起泡穩(wěn)定性均表現(xiàn)出一定程度的升高。該結(jié)果與Odríguez等[13]的研究結(jié)果類(lèi)似，蛋白-多酚復(fù)合物可以表現(xiàn)出更高的固有黏度由此有效地降低排水速度，產(chǎn)生更穩(wěn)定的泡沫。多酚類(lèi)物質(zhì)的加入降低了蛋白界面的表面壓力，使得蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，并且與蛋白發(fā)生相互作用，使得界面薄膜變得更加穩(wěn)定[27]。此外，樣品6的起泡特性比樣品3提高了16.52%，這可能是由于共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)可以有效地提高蛋白在氣/液表面的展開(kāi)，形成更多泡沫網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并提高界面彈性，通過(guò)抑制蛋白聚集和歧化增強(qiáng)了泡沫的形成[28-29]。蛋白質(zhì)分子顆粒的大小是影響起泡特性的關(guān)鍵因素之一，適當(dāng)分子質(zhì)量的可溶性聚合物有助于改善起泡特性[14]。

2.2 乳化特性與乳化穩(wěn)定性

圖2 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對(duì)蛋白乳化特性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effects of anthocyanin binding to SPI on its emulsifying properties and emulsion stability

大豆分離蛋白的乳化特性是最重要的功能性質(zhì)之一，主要包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。乳化活性指蛋白質(zhì)-花青素復(fù)合物在形成油水界面上促進(jìn)形成穩(wěn)定界面的能力，乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)-花青素復(fù)合物乳狀液維持形成小液滴的抗應(yīng)變能力，可分別用乳化特性和乳化穩(wěn)定性表達(dá)其測(cè)定結(jié)果[30]。如圖2所示，與未經(jīng)處理的蛋白溶液相比，在非共價(jià)結(jié)合（pH 7.4、2 h）和共價(jià)交聯(lián)（pH 9.0，24 h）處理?xiàng)l件下，復(fù)合液的乳化特性明顯逐步升高，其中，樣品6的乳化特性相比于空白組增大了71.94 %，樣品3的乳化特性相比于空白組增大64.93%，表明由于花青素的加入提升了溶液的乳化活性。這與胡思等[31]的研究結(jié)果一致，適量茶多酚的添加可增強(qiáng)小麥面筋蛋白在O/W界面上的牢固性，形成較穩(wěn)定的界面膜。部分活化的多酚羥基與蛋白質(zhì)殘基結(jié)合從而提高了蛋白的乳化能力。并且在堿性條件下酚類(lèi)小分子的出現(xiàn)，可以減少油相和水相之間的界面張力[14]。以上結(jié)果表明花青素可能改變了蛋白質(zhì)表面性質(zhì)，并且不可逆的共價(jià)結(jié)合更有助于多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的綁定，由此導(dǎo)致了相應(yīng)乳化特性的提高。此外，花青素的加入使得乳化穩(wěn)定性指數(shù)在不同程度上有所增加，這顯示了花青素-蛋白復(fù)合物比空白樣具有更好的乳化穩(wěn)定性。多酚的加入會(huì)掩蓋部分蛋白的解折疊，限制了蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，提高乳液穩(wěn)定性并延長(zhǎng)貯藏時(shí)間[32]。

2.3 復(fù)合物乳液光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖3 復(fù)合物乳液光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖Fig. 3 Microstructure of composite emulsions

如圖3所示，未加入花青素的蛋白乳液體系中乳滴大小分布不均，圖3中有部分乳滴發(fā)生聚集，這可能是在該條件下蛋白質(zhì)在水相溶液中乳滴較大，極易產(chǎn)生不溶性聚集體。樣品1、2、4乳液體系中乳滴形狀相比于空白蛋白乳液體系有所減小，但仍有部分不均一的乳滴存在。樣品3乳液體系中乳滴較為均一，但部分乳狀液未被油脂包裹分散在外。樣品5、6乳液體系中乳滴大小分散均勻且均一，油脂包裹乳液情況良好，乳液穩(wěn)定?；ㄇ嗨氐募尤胧沟脧?fù)合物中蛋白乳滴粒徑減小，分布均勻，顯示出了較好的乳化能力，有助于提高乳液的穩(wěn)定性[33]。復(fù)合乳液體系微觀結(jié)構(gòu)的改變與乳化活性和穩(wěn)定性的結(jié)果一致。

2.4 巰基含量的分析

表2 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對(duì)蛋白巰基含量的影響Table 2 Effect of anthocyanin binding to SPI on its sulfhydryl content

巰基作為蛋白質(zhì)中的重要功能基團(tuán)之一，具有較高的生物活性，對(duì)蛋白質(zhì)在面筋、凝膠的形成中起著重要的作用[34]。由表2可知，蛋白質(zhì)中巰基含量經(jīng)2 種相互作用隨著花青素含量的增加而有所改變。與未加入花青素的蛋白相比，花青素的引入降低了大豆分離蛋白中的巰基含量，花青素作為水溶性物質(zhì)含有大量的羥基基團(tuán)，蛋白中的巰基基團(tuán)可以與花青素中的羥基相結(jié)合，改變蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)[35]。并且在所有樣品中，樣品4～6復(fù)合物中的巰基含量下降尤為明顯。隨著花青素的加入，巰基基團(tuán)含量不斷下降，這可能是由于部分巰基被氧化成二硫鍵或是二硫鍵相互轉(zhuǎn)換。此外，花青素與蛋白在堿性處理?xiàng)l件下產(chǎn)生的醌類(lèi)物質(zhì)也可直接與巰基發(fā)生相互作用形成C—S共價(jià)鍵，從而極大的降低了巰基在蛋白中的含量[36]。

2.5 三維熒光光譜分析

圖4 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對(duì)蛋白影響的三維熒光光譜分析圖Fig. 4 Three dimensional fluorescence spectral analysis of the effect of anthocyanin binding to SPI on protein structure

三維熒光光譜可以通過(guò)表達(dá)蛋白的熒光信息，從而對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[37]。峰a（λEx=λEm）為瑞利散射峰，峰b（λEm=2λEx）是二階散射峰[38]。由圖4可知，在λEx=280 nm，λEm=340 nm處主要是蛋白質(zhì)中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的特征峰（峰1）[39]。加入花青素后特征峰處的顏色變淺，等高線逐漸稀疏，與未加入花青素的蛋白溶液相比，樣品1的峰1處熒光強(qiáng)度降低了78.51%，樣品4在此處的熒光強(qiáng)度降低了87.43%。這表示大豆分離蛋白熒光強(qiáng)度隨著花青素的加入逐漸降低。該結(jié)果表明大豆分離蛋白和花青素之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。表明蛋白質(zhì)與花青素之間的相互作用在不斷增強(qiáng)，蛋白質(zhì)中部分Trp和Tyr殘基的疏水基團(tuán)被掩埋在花青素-花青素復(fù)合物的疏水區(qū)域中。此外，樣品4～6中復(fù)合物對(duì)大豆分離蛋白的猝滅能力比樣品1～3表現(xiàn)的更強(qiáng)，該結(jié)果表明花青素經(jīng)堿性氧化生產(chǎn)的醌類(lèi)物質(zhì)與部分氨基酸殘基結(jié)合，導(dǎo)致了大豆分離蛋白與花青素發(fā)生了額外的共價(jià)交聯(lián)作用。此外，峰2（λEx=230 nm，λEm=350 nm），它主要代表了多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰[39]。在添加花青素后復(fù)合物中該區(qū)域的面積逐漸減小，表明該復(fù)合物使得蛋白質(zhì)多肽鏈解折疊隨之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。以上2 個(gè)特征峰熒光強(qiáng)度的降低表明多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)多肽鏈的輕微解折疊[26]。

3 結(jié) 論

采用共價(jià)及非共價(jià)處理手段探究其對(duì)大豆分離蛋白與花青素相互作用及復(fù)合物功能性質(zhì)的影響。采用起泡特性及起泡穩(wěn)定性、乳化特性及乳化穩(wěn)定性分析方法，從宏觀上測(cè)定蛋白質(zhì)-花青素復(fù)合體系的功能性質(zhì)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡的觀察微觀分析復(fù)合乳化體系的結(jié)構(gòu)，巰基含量的測(cè)定和三維熒光光譜分析對(duì)解析復(fù)合體系結(jié)構(gòu)提供了重要的指導(dǎo)信息。

研究得出以下結(jié)論：花青素的加入能夠改善大豆分離蛋白復(fù)合體系的乳化特性與起泡特性等功能性質(zhì)，且大豆分離蛋白部分功能特性在共價(jià)處理?xiàng)l件下的提高程度高于非共價(jià)處理?xiàng)l件。復(fù)合乳液乳滴大小分散均勻，油脂包裹乳液情況有所改善，乳液均一穩(wěn)定，提高了乳液的乳化穩(wěn)定性。結(jié)果表明花青素的加入改變蛋白界面特性，使界面薄膜變得更加穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)巰基基團(tuán)結(jié)果表明，復(fù)合物中巰基含量經(jīng)非共價(jià)/共價(jià)作用影響隨著花青素質(zhì)量濃度的增加而提高，并且在共價(jià)作用下產(chǎn)生的醌類(lèi)物質(zhì)極大降低了巰基在蛋白中的巰基含量。

隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物溶液的熒光強(qiáng)度明顯降低。結(jié)果表明蛋白質(zhì)與花青素之間的相互作用在不斷增強(qiáng)，使得發(fā)色基團(tuán)被不斷猝滅，蛋白質(zhì)多肽鏈解折疊隨之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

以上結(jié)果表示多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物蛋白的起泡及乳化特性有不可忽視的影響。對(duì)于植物蛋白改性與深加工都有重要意義。參考文獻(xiàn)：

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