嚴瑞紅 盧宏柱

1長江大學第一臨床醫(yī)學院兒科（湖北荊州434000）；2公安縣人民醫(yī)院兒科（湖北荊州434300）

微小病變?。∕CD）是特發(fā)性腎病綜合征之一。臨床上以大量蛋白尿，低蛋白血癥，高脂血癥，水腫為主要特征［1?2］。病理上表現(xiàn)為電鏡下可見足細胞足突融合或消失，而沒有其他結(jié)構(gòu)上的改變，也沒有免疫復合物的沉積。血漿蛋白，尤其是白蛋白，怎樣通過腎小球濾過屏障從尿中排出至今仍不十分清楚。近年來，各國研究者對MCD蛋白尿產(chǎn)生的機制進行了大量的研究，本文對此進行綜述。

1 腎小球濾過屏障負電荷減少

1.1內(nèi)皮細胞表面負電荷分子因為內(nèi)皮細胞穿孔的大小的原因，常不被看作是阻止蛋白轉(zhuǎn)送到Bowman氏囊的主要原因。直到后來發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞表面覆蓋的足細胞標記蛋白（podocalyxin），一種負電荷蛋白，可以減少穿孔的直徑，推測可能使白蛋白通過內(nèi)皮細胞運動受阻，但目前還沒有實驗研究來證實這一假說。

1.2腎小球基底膜（GBM）負電荷減少GBM是負電荷存在的主要場所之一。在MCD發(fā)展中，GBM的低密度層的負離子場所減少［3］，硫酸類肝素/尿肌酐比值增加［4］。臨床研究還發(fā)現(xiàn)用低分子肝素治療小兒原發(fā)性腎病綜合征有利于減少蛋白尿，其機制可能是彈性蛋白酶減少了GBM上的葡糖氨基葡聚糖，使GBM上負電荷減少，低分子肝素通過抑制彈性蛋白酶而起作用［5］。因此GBM上的負電荷減少是MCD的原因之一。GOLDBERG等［6］敲除agrin和perlecan基因，使蛋白聚糖缺乏，GBM的負電荷顯著減少，但小鼠不發(fā)生蛋白尿，清除分數(shù)也無變化。作者認為硫酸類肝素蛋白聚糖可能只有部分表型改變，但不發(fā)生MCD。在相似的研究中CHEN等［7］敲除Extl基因，小鼠足細胞表達此基因，足細胞分泌的糖蛋白核心蛋白多聚體受阻，小鼠表現(xiàn)為足突融合，免疫組化分析顯示硫酸類肝素糖蛋白下降，盡管足突融合以及硫酸類肝素的丟失，基因敲除小鼠只表現(xiàn)出輕微的白蛋白尿。VAN DEN HOVEN等［8］用小鼠過表達肝素酶去評估不同硫酸類肝素區(qū)域，用抗硫酸類肝素抗體去評估腎臟內(nèi)不同區(qū)域的硫酸類肝素粘多糖相關(guān)的陰離子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因鼠表達呈5倍減少，而腎小球結(jié)構(gòu)和蛋白分泌正常。

1.3導致GBM上負電荷丟失的介質(zhì)目前發(fā)現(xiàn)至少有3種介質(zhì)在GBM負電荷丟失中起到了關(guān)鍵的作用。這3種分子被認為是GBM負電荷丟失的介質(zhì)：促血管新生蛋白因子樣?4（angiopoietin?4，angptl?4），IL?8 以及血液結(jié)合素（hemopexin，Hx）。

人類anglptl?4是分子量在45～65 kD的糖蛋白，被認為是MCD產(chǎn)生蛋白尿的一種介質(zhì)，在MCD患者的血漿、尿和腎小球中均發(fā)現(xiàn)Angptl?4寡聚體220 kD，PI＜ 8，在4個MCD患者中檢出，其中一個人尿中也存在，分子量55～70 kD，PI＞ 8。同樣，angptl?4寡聚體100～600 kD，PI＜ 8和angptl?4分子Pl＞8，在部分MCD患者血中檢測出。血清angptl?4水平在MCD、FSGS 和膜性腎病活動期增高［9］。腎組織免疫熒光顯示弱染色，它位于足細胞、GBM和內(nèi)皮細胞。Angptl?4在MCD中的可能機制包括足細胞分泌angptl?4（大多數(shù)Pl＞8）轉(zhuǎn)移到GBM和內(nèi)皮細胞，導致GBM負電荷減少，而出現(xiàn)蛋白尿［10］。在另一組MCD患者中，尿中angptl?4與尿蛋白呈正相關(guān)，在MCD復發(fā)組較對照組尿中angptl?4增高。這可能是結(jié)果而不是腎小球濾過屏障滲漏的原因。的確，尿中angptl?4的水平在其他類型腎小球疾病也增高，如局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）、膜性腎病等。而且，血清angptl?4水平在MCD的復發(fā)期較緩解期及對照組下降，另外，與以前的研究比，MCD復發(fā)的腎組織中angptl?4免疫熒光陰性或很弱。最重要的是在人類足細胞培養(yǎng)中加入MCD患者血清，包括復發(fā)期和緩解期，足細胞表達angptl?4不增加。最近還沒有發(fā)現(xiàn)尿中陽離子型angptl?4（PI＞ 8）。在MCD復發(fā)期，發(fā)現(xiàn)了PI5.4的angptl?4，因此，挑戰(zhàn)了這一學說。一個高PI的angptl?4是MCD蛋白尿的介質(zhì)?？傊?，angptl?4在MCD中的臨床意義還有待進一步確定。

血清IL?8在MCD復發(fā)期較緩解期和對照組增高。給大鼠注射IL?8血清水平達到MCD患者相似的濃度，表現(xiàn)出輕度的蛋白尿，用抗IL?8中和抗體可預(yù)防蛋白尿，提示IL?8與蛋白尿之間存在因果關(guān)系［11］。另外，給大鼠注入IL?8可增加GBM氨基葡聚糖的分解代謝。這些資料提示循環(huán)的IL?8在產(chǎn)生蛋白尿的某些作用是通過降低硫酸類肝素蛋白聚糖的合成，從而減少GBM的陰離子電荷，最后導致蛋白尿［12］。

Hx是肝臟合成的一種蛋白質(zhì)，其受體在肝細胞、神經(jīng)元和巨噬細胞中均有表達，但至今未發(fā)現(xiàn)其受體在腎臟表達。但Hx可以改變腎臟裂孔膜蛋白的信號轉(zhuǎn)導及neph?rin，podocin，CD2AP蛋白的移位，在各種感染和炎癥急性期均增高，血漿純化和重組的Hx有絲氨酸酶活性，循環(huán)的Hx是無活性的，活化的Hx對腎小球濾過屏障有重要的作用，Hx可以使唾液酸糖蛋白和陰離子減少，大鼠實驗發(fā)現(xiàn)Hx可以使足細胞足突消失，并出現(xiàn)可逆的蛋白尿［12?13］，從正常人血漿中分離出來一個片段，稱為100 KF片段，分子量為80～100 kD。把它注射到小鼠，15 min后GBM低密度區(qū)負電荷減少，尿蛋白分泌增加［14］。筆者認為這一作用是Hx所致。然而，Hx作為MCD的致病因素還缺乏直接證據(jù)。

2 足細胞在MCD中的作用

2.1足細胞骨架與裂孔膜的變化MCD是一種足細胞病，腎小球?qū)ρ獫{蛋白通透性的增加是因為足細胞骨架的改變使裂孔膜滲漏，導致蛋白尿。裂孔膜蛋白在維持足細胞骨架穩(wěn)定中起到了重要作用。足細胞損傷與白蛋白排泄有著密切的聯(lián)系［15］。動物實驗表明，敲除podocin基因NPHS2，可以導致蛋白尿，在少量蛋白尿時，電鏡觀察足細胞足突正常，當大量蛋白尿時，出現(xiàn)足突融合或消失［16］。

2.1.1Nephrin在維持足細胞骨架中的作用Nephrin是較早發(fā)現(xiàn)的裂孔膜蛋白之一，在維持裂孔膜穩(wěn)定性中起到重要作用，nephrin丟失多的患者，療效及遠期預(yù)后不佳［17］，在眾多的研究中也發(fā)現(xiàn)MCD患者足細胞nephrin表達下降，目前只能認為部分MCD可能與nephrin表達下降有關(guān)。

Nephrin蛋白的磷酸化是維持足細胞結(jié)構(gòu)與功能的重要因素，是SD與細胞骨架信號轉(zhuǎn)導中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［18］。但用不同方法研究nephrin在MCD中的作用得出了矛盾的結(jié)果。一些研究表明腎小球nephrin表達在MCD與正常對照組中無差別。也有證據(jù)顯示nephrin mRNA表達下降。這些相互矛盾的結(jié)果部分解釋原因可能是使用的研究方法的不同。因此，只能認為MCD nephrin表達下降沒有確切的依據(jù)。

Nephrin有調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的作用。Nephrin磷酸化下降導致蛋白尿，在MCD患者中，nephrin磷酸化py228比正常腎小球下降。與這一研究相同的，在py1217位neph?rin磷酸化在MCD患者腎小球中的表達在蛋白尿期比緩解期下降。把足細胞與MCD復發(fā)的患者血清培養(yǎng)和與緩解期血清培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者nephrin磷酸化下降。從形態(tài)學上發(fā)現(xiàn)肌動蛋白重組也發(fā)生改變，基于這些發(fā)現(xiàn)，推測足細胞骨架改變破壞了SD的正常形態(tài)，導致SD通透性增高，從而出現(xiàn)蛋白尿［19］。Nephrin磷酸化是MCD損傷的機制仍不十分清楚。目前發(fā)現(xiàn)3種蛋白可能對nephrin磷酸化過程起到干擾作用，它們分別是CD80、c?mip和SHP?1。

CD80（也稱B7?1）是足細胞表達的一種跨膜蛋白，足細胞CD80與蛋白尿之間的聯(lián)系基于一個實驗。注射LPS小鼠足細胞表達CD80增加，足突消失，并出現(xiàn)蛋白尿，相比之下，CD80敲除小鼠注射LPS沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。內(nèi)皮素?1 A型受體拮抗劑有抗蛋白尿的作用，這一作用是通過抑制足細胞表達CD80而實現(xiàn)［20］。在MCD患者尿中CD80增高，外周血單個核細胞CD80 mRNA表達增高，而其他腎小球疾?。‵SGS、LN）尿中CD80不增高［10，21］。尿中CD80的來源是足細胞，理由是：首先、S?CD80低血清水平（可溶性CD80的分子量是23 kD）復發(fā)的MCD患者較正常對照組下降［21］。其次、尿中CD80分子是53 kD，與整個細胞膜相關(guān)的CD80一致，與循環(huán)的可溶性CD80相反，循環(huán)的CD80是B細胞產(chǎn)生的。尿中的CD80與MCD也有密切的關(guān)系，并且可以作為判斷MCD對激素治療反應(yīng)的指標之一［22］。最近研究［10］發(fā)現(xiàn)，CD80在7個MCD患者復發(fā)期的腎小球中全部存在，但在2個FSGS患者中微量或不存在，在一個MCD患者緩解期也缺失，所有復發(fā)期的7個MCD患者小管上皮細胞染色沒有CD80。另一項研究還發(fā)現(xiàn)人的足細胞與MCD復發(fā)患者血清培養(yǎng)CD80表達增加，并伴隨著nephrin磷酸化減少，而用緩解期患者血清培養(yǎng)沒有這種現(xiàn)象，因此可以認為，CD80可能干擾nephrin磷酸化和抑制Fyn和（或）Nck蛋白。動物實驗還發(fā)現(xiàn)TNF?α，polyI：C、LPS和IL?13也刺激足細胞表達CD80，過表達的CD80和Neph1通過細胞外域相互作用，導致裂孔膜破壞［23］。這些結(jié)果都支持一個假說，一種循環(huán)因子介導蛋白尿。

C?mip是一個86 kD蛋白，Balb/c和SCID小鼠暴露于LPS可以導致蛋白尿和足細胞c?mip過表達，用c?mip siR?NA預(yù)處理小鼠再注射LPS，明顯的降低蛋白尿，提示在c?mip和蛋白尿之間有一定的聯(lián)系。足細胞c?mip轉(zhuǎn)基因小鼠足細胞足突消失，大量蛋白尿伴有nephrin磷酸化減少，以及活化的Fyn。用重組的IL?17與小鼠足細胞培養(yǎng)，可導致足細胞凋亡和細胞骨架紊亂，這一作用是IL?17使C?mip過表達，從而下調(diào)磷酸化nephrin和Bcl?2水平而起作用［24］。用免疫組化和原位雜交技術(shù)在MCD復發(fā)期腎小球c?mip較恢復期增高。在Reed?Sternberg細胞和Hodgkins淋巴瘤發(fā)展為MCD的患者c?mip選擇性表達，而在Hodgkins患者沒發(fā)生蛋白尿時c?mip不表達。最近對1例小細胞型肺癌患者并發(fā)腎病綜合征的研究發(fā)現(xiàn)，c?mip在足細胞和肺癌細胞中過表達，把患者血清與人足細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)足細胞骨架紊亂，并且誘導c?mip表達，說明c?mip在小細胞型肺癌相關(guān)的足細胞病中起到重要的作用［24］。體外實驗及動物研究表明足細胞c?mip與Fyn結(jié)合阻止他與nephrin作用，導致nephrin磷酸化減少，從而改變下游的連接SD和細胞骨架蛋白信號級聯(lián)反應(yīng)［25］。C?mip在MCD的臨床關(guān)聯(lián)性還不清楚，因為（1）Fyn缺陷小鼠表現(xiàn)出蛋白尿上調(diào)足細胞c?mip、使人想到c?mip是Fyn失調(diào)的結(jié)果，而不是原因；（2）把人的足細胞與MCD患者復發(fā)期血清培養(yǎng)和與緩解期血清培養(yǎng)，F(xiàn)yn表達無變化，這一發(fā)現(xiàn)與假說機制MCD患者c?mip抑制Fyn相矛盾，c?mip可能反映出足細胞對noxa的非特異性效應(yīng)。

SHP?1屬于PTPs家族，在蛋白酪氨酸激酶如Fyn和PTPs之間的緊密調(diào)節(jié)，是維持靶蛋白，如nephrin磷酸化穩(wěn)定水平必須的，反過來調(diào)節(jié)下游信號通路。在高糖下培養(yǎng)人足細胞過表達SHP?1導致nephrin磷酸化選擇性位點在Tyr1193和Tyr1217殘基，SHP?1抑制防止nephrin磷酸化提示在SHP?1和nephrin之間有聯(lián)系［26］。

2.1.2半乳糖凝集素1半乳糖凝集素1（Galectin?1，Gal?1）是一個135個氨基酸組成的蛋白，基因為LSGALS1。是細胞運動、黏附和免疫修飾劑。在人類腎小球內(nèi)皮細胞和系膜細胞表達，另外，它與nephrin胞外域共存，人類足細胞與重組的Gal?1培養(yǎng)，表現(xiàn)出nephrin磷酸化增加，提示Gal?1在SD中起到了一個信號介導作用，在MCD復發(fā)患者的研究中發(fā)現(xiàn)腎小球Gal?1表達下降。最近，OSTALSKA等［27］發(fā)現(xiàn)在MCD和對照組中均無Gal?1表達，而在FSGS和彌漫性系膜增生患者足細胞中檢測出。

2.1.3血液結(jié)合素體外實驗表明Hx通過減少nephrin依賴的細胞骨架改變介導蛋白尿。細胞骨架改變是Hx色氨酸蛋白酶活化的結(jié)果，因為當足細胞暴露在Hx低劑量蛋白酶抑制劑AEBSF減少肌動蛋白纖維的重排，這一發(fā)現(xiàn)的意義仍不清楚，因為蛋白酶抑制劑SPI具有肌動蛋白重排的獨立作用，用10%正常人血漿預(yù)處理，可以完全阻斷Hx對肌動蛋白重排作用。

2.2F?actin與SD蛋白的相互作用Synaptopodin免疫組化研究MCD患者顯示較對照組減弱。但另個研究發(fā)現(xiàn)無差異。HORIONUCHI等［28］發(fā)現(xiàn)兒童腎病綜合征MCDpodo?cin降低，包括激素耐藥型腎病綜合征?？赡芘cNPHS2突變有關(guān)。相反，另一個研究6例MCD用免疫組化的方法，與對照組沒差別［28］。

2.3足細胞與GBM之間的黏附蛋白α?dystroglycane（α?DG）和唾液酸苷酶在MCD和4個正常腎小球中的表達，以及尿中唾液酸兩組無差別。在MCD中，α?DG的表達較正常降低25%～50%因為α?DG免疫金標更強，前者得到的值更確切地反應(yīng)其病理生理特點。更有趣的是經(jīng)激素治療的MCD患者α?DG的表達明顯恢復，然而，低表達α?DG的現(xiàn)象不能得出是因為低濃度α?DG而導致的蛋白尿。最近在小鼠發(fā)現(xiàn)無α?DG腎小球足細胞足突變平但沒有蛋白尿。

整合素：BARADI等［29］研究整合素家族亞單位用熒光免疫方法，6個正常腎組織和10個MCD、膜性腎病和狼瘡性腎炎，在正常腎小球人a3為主要的整合素熒光呈線性沿GBM分布，在MCD和狼瘡性腎炎a3染色正常。LAH?DENKARI等［30］發(fā)現(xiàn)MCD和芬蘭型先天性腎病綜合征伴大量蛋白尿者足細胞與GBM也緊密結(jié)合。

3 調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）與MCD機制之間的關(guān)聯(lián)

Tregs是一種動態(tài)的細胞群體：在平衡狀態(tài)下，它們的水平較低。幾乎所有蛋白尿模型都證實了低Tregs和蛋白尿之間有著密切聯(lián)系［31］，低Tregs和蛋白尿之間的關(guān)系取決于觀察的時間點，動物試驗表明：（1）阿霉素腎病可以通過輸注Foxp3轉(zhuǎn)導的T細胞或通過輸注腺苷或通過使用低劑量IL?2來調(diào)節(jié)；在所有這些病例中，循環(huán)Tregs上調(diào)，蛋白尿下調(diào)［32］；（2）將Tregs直接輸入Buffalo/Mna大鼠與蛋白尿減少和腎臟病變消退有關(guān)；（3）在LPS腎病中也研究了Tregs的作用，它代表了瞬時蛋白尿的模型；在這種情況下，通過使用IL?2/抗IL?2免疫復合物調(diào)節(jié)Tregs水平，誘導CD4+細胞分化成 Tregs［33］。輸注IL?2/抗 IL?2可以減少阿霉素腎病大鼠的蛋白尿，改善腎功能。也有相關(guān)實驗在用LPS處理的小鼠中，使用相同的方法使得蛋白尿的減少。在用他克莫司治療SRNS的過程中，發(fā)現(xiàn)病理類型為MCD患兒，其臨床癥狀完全緩解率要低于MsPGN和FSGS；反而其復發(fā)率要高于MsPGN和FSGS［34］。利妥昔單抗與SMP?DL?3b的相互作用可誘導的足細胞肌動蛋白重塑，從而恢復了足細胞的結(jié)構(gòu)和功能［35］。已有很多實驗證明Th17與腎臟疾病的發(fā)生有著莫大的聯(lián)系，在觀察到低劑量重組IL2是安全的并且可以在人類中使用后，Treg水平的調(diào)節(jié)已成為MCD的一種新的潛在治療方法。但目前關(guān)于Tregs在人MCD中的作用的證據(jù)很少，還需進一步研究。

4 結(jié)論與展望

MCD蛋白尿的產(chǎn)生是復雜的，內(nèi)皮細胞及GBM層負電荷的減少可能是原因之一，但目前沒有足夠的證據(jù)證明這一點。目前更多的學者認為MCD是一種足細胞病，足細胞nephrin，CD80等蛋白的表達異常在蛋白尿的產(chǎn)生中可能起到了激發(fā)作用，動物實驗發(fā)現(xiàn)Treg水平也與蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)，但是導致蛋白尿的確切機制仍不清楚。今后對MCD的研究重點是找出特異性的異常點，以便針對靶點進行特異性的治療，從而取代全身免疫抑制的治療方法。