馬睦棣，陳燦

(1廣東醫(yī)科大學(xué)心血管疾病研究室，廣東湛江 524001 2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

干細胞療法對心血管疾病治療的研究主要集中在如何讓移植細胞高效彌補損失心肌細胞和組織。間充質(zhì)干細胞(MSCs)的直接心內(nèi)膜移植已被證明是相對安全的，但MSCs移植可導(dǎo)致心肌、血管損傷。血管內(nèi)移植可導(dǎo)致遠端微血管閉塞；移植的活細胞可能出現(xiàn)腫瘤性生長和意外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等其他細胞類型；且細胞還可因與宿主心肌或血管組織耦聯(lián)失敗而誘發(fā)心律失常[1]。MSCs來源外泌體的發(fā)現(xiàn)將心血管疾病的治療引入了新思路。外泌體可以避免可溶性生物因子傳遞過程中遇到的難題，具有磷脂膜囊泡結(jié)構(gòu)的外泌體不僅能負載大量的生物因子，還能保護內(nèi)容物免受降解酶或化學(xué)物質(zhì)的侵害并將其傳遞到靶細胞，在內(nèi)環(huán)境中維持信號物質(zhì)的生物活性[2]。在體外通過鑒定MSCs來源外泌體中的成分并篩選出心臟保護因子，可降低旁分泌途徑中有害物質(zhì)傳遞到靶細胞的概率，這更符合臨床應(yīng)用的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。MSCs來源外泌體無法代替移植細胞彌補丟失的心肌細胞，但其可減少MSCs移植手術(shù)導(dǎo)致的心肌和血管損傷?，F(xiàn)將MSCs來源外泌體對心肌和血管的保護作用研究進展綜述如下。

1 MSCs來源的外泌體的功能

MSCs最初來源于早期胚胎發(fā)育過程中的中胚層和外胚層，存在脂肪組織、骨膜、肝、肺和肌肉組織等組織和器官中。MSCs具有多種獲取途徑，可通過抽吸骨髓內(nèi)容物、脂肪等分離提取，且體外增殖能力高。MSCs的免疫抑制性使其可用于同種異體間的移植[2]。在一定刺激下，MSCs可分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，可修復(fù)心肌梗死后心臟，重建心臟血運[3]。但移植后僅有少數(shù)MSCs存活并發(fā)揮作用，多數(shù)移植MSCs無法分化為特定細胞類型，表明可能存在其他機制調(diào)控MSCs的生物功能。MSCs可分泌多種調(diào)節(jié)血管生成、免疫應(yīng)答的細胞因子和生長因子，對心臟起保護作用，如促進血管再生、促進心肌修復(fù)和改善心臟重塑等[4]。

外泌體最初被認為只是在網(wǎng)織紅細胞成熟期間形成的小囊泡，介導(dǎo)清除來自紅細胞中不需要的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。干細胞等多種細胞類型均可釋放外泌體。細胞間在進行物質(zhì)信息傳遞時會分泌大量外泌體、微泡體、核外顆粒和凋亡小體等質(zhì)膜微囊，其中發(fā)揮主要信息傳遞效應(yīng)的是外泌體[5]。外泌體包含在多泡體(MVB)[6]內(nèi)，具有與宿主細胞膜相同的膜取向，富含脂質(zhì)、膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等。外泌體主要作為內(nèi)源性蛋白質(zhì)與核酸等物質(zhì)的運輸載體，通過受體-配體的相互作用、膜融合或靶細胞內(nèi)化等方式在細胞間進行信息傳遞[5]。

MSCs來源外泌體對心肌、血管細胞間的信號傳遞和心血管疾病的發(fā)病機制、治療方案等研究均具有重要價值。MSCs來源外泌體具有磷脂膜囊泡結(jié)構(gòu)，不僅能負載大量的生物因子，還能保護內(nèi)容物免受降解酶或化學(xué)物質(zhì)的侵害并將其傳遞到靶細胞，在內(nèi)環(huán)境中維持信號物質(zhì)的生物活性[7]。

2 MSCs來源外泌體對心肌和血管的保護作用

2.1 促進心肌細胞增殖，抑制心肌細胞凋亡 心肌細胞屬于不可再生細胞，在心肌梗死后心肌細胞不可避免地發(fā)生進行性壞死和凋亡。MSCs來源外泌體可促進心肌細胞增殖、抑制細胞凋亡，在抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中起重要作用。細胞凋亡伴隨DNA損傷，出現(xiàn)核p53誘導(dǎo)PUMA蛋白(可抑制抗凋亡BCL-2譜系)的表達。PUMA蛋白破壞胞質(zhì)p53和抗凋亡蛋白BCL-xL間相互作用，促進p53直接活化BAX和BAK，最終促進細胞凋亡[8]。Yu等[9]發(fā)現(xiàn)，過表達GATA-4基因的MSCs可分泌高表達miR-221的細胞微泡(MVs)，miR-221可通過降低PUMA蛋白的表達，抑制細胞凋亡，并顯著增強其對心臟的保護作用。因此，MSCs來源外泌體在細胞凋亡后通過miR-221介導(dǎo)抑制PUMA蛋白，彌補DNA損失帶來的負面影響而起到抗凋亡作用。Yu等[10]最新研究發(fā)現(xiàn)，過表達GATA-4的 MSCs分泌的外泌體中還高表達miR-19a(抗凋亡相關(guān)miRNA)，并通過特異性下調(diào)PTEN 蛋白激活 AKT 及ERK信號通路，提高心肌梗死后心肌細胞的存活率。研究[11]報道，缺血預(yù)處理后MSCs分泌的富含miR-22的外泌體可減少心肌細胞凋亡，改善心肌缺血性損傷，而miR-22的抗凋亡作用是通過直接靶向Mecp2蛋白所介導(dǎo)的。

攜帶miRNA的MSCs來源外泌體通過直接靶向凋亡相關(guān)蛋白而抑制心肌細胞凋亡，且一定程度改善心臟功能，即MSCs來源外泌體作為生物制劑可根據(jù)心臟疾病發(fā)病的分子機制作具體治療，并且其靶向性使得治療更具有目的性；同時MSCs來源外泌體的靶向治療不良反應(yīng)少。

2.2 抑制血管重構(gòu) 血管重構(gòu)是基于血流動力學(xué)改變所引起的血管適應(yīng)性反應(yīng)，其中涉及細胞的增殖、遷移以及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解。MSCs來源的外泌體對血管的保護作用除了促進血管新生，還可抑制血管重構(gòu)。研究[12]報道在肺動脈高壓的大鼠模型中，MSCs經(jīng)靜脈內(nèi)和氣管內(nèi)移植均可降低肺動脈壓力和減輕肺動脈重塑，可能是MSCs通過分泌活性物質(zhì)抑制Smad2磷酸化而實現(xiàn)的，說明MSCs的旁分泌活性可抑制血管重構(gòu)。MSCs分泌的外泌體通過抑制過度增殖途徑(包括STAT3介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)信號通路)和上調(diào)肺組織miR-204表達(降低人肺動脈高壓的一種關(guān)鍵miRNA)抑制肺動脈高壓，對肺發(fā)揮多重保護作用[13]。但是MSCs來源外泌體抗血管重構(gòu)作用的相關(guān)機制報道較少，外泌體可能是通過抑制內(nèi)皮細胞的惡性增殖和遷移來抑制血管重構(gòu)，并且其抗凋亡和抗炎癥的作用同樣不容忽視，因此仍需要進一步探索其抗血管重構(gòu)的更深層相關(guān)分子機制和信號通路。

2.3 抑制心肌、血管的炎癥反應(yīng) MSCs來源外泌體可抑制肺內(nèi)巨噬細胞流和炎癥因子所引起的肺血管炎癥反應(yīng)[13]。MSCs來源外泌體主要在體內(nèi)外通過抑制巨噬細胞的促炎性M1狀態(tài)和增強抗炎性M2狀態(tài)來調(diào)節(jié)其表型，并有效地改善肺動脈高壓小鼠肺泡纖維化，改善肺功能[14]。Aliotta等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓小鼠模型中伴隨相關(guān)miRNA水平的升高，而從MSCs來源外泌體中分離出的miRNA可提高小鼠體內(nèi)抗炎相關(guān)miRNA的水平，說明MSCs來源外泌體可調(diào)節(jié)miRNA相關(guān)的肺動脈高血壓效應(yīng)。

心肌梗死導(dǎo)致心肌壞死的病理生理過程中伴隨著炎癥反應(yīng)，炎癥不僅是早期動脈粥樣硬化進展為心肌梗死的關(guān)鍵因素，且血管炎癥與未來患者發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險有關(guān)。他汀類藥物短期療法可降低心血管事件發(fā)生的風(fēng)險，因其可抑制斑塊內(nèi)巨噬細胞浸潤[16]。抑制炎癥反應(yīng)在心血管疾病中對心肌的保護具有重要意義。MSCs來源外泌體不僅能提高心肌中ATP和NADH的水平，還能減少心肌缺血/再灌注損傷后白細胞的浸潤[17]。MSCs來源外泌體通過抑制T細胞增殖而限制其發(fā)揮功能，并可抑制炎癥細胞的浸潤，減少趨化因子的分泌，最終避免其它免疫細胞進入受影響的心臟區(qū)域[18]，減輕炎癥反應(yīng)。

免疫細胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對心肌和血管組織而言是不可逆轉(zhuǎn)的，而MSCs來源外泌體作為良好的生物制劑不僅能有效避免免疫細胞相關(guān)的排斥反應(yīng)，還能在病理情況下通過抑制免疫細胞的數(shù)量減輕其對組織的損害，對于延緩疾病的進展以及保護心肌和血管有重要的價值。

2.4 修復(fù)受損心肌和血管 MSCs的移植和定向分化對心肌修復(fù)的效果并不明顯，其主要以旁分泌的方式介導(dǎo)心臟組織結(jié)構(gòu)與功能的修復(fù)。MSCs分泌的活性物質(zhì)對心臟組織修復(fù)和心功能的恢復(fù)具有治療價值，其治療效益不依賴于細胞移植和隨后的分化。Lai等[19]進一步在心肌缺血/再灌注損傷的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，移植的MSCs中有豐富的外泌體顆粒，這些純化的外泌體不僅可以減少梗死面積，還可以增強心肌組織的修復(fù)。Ma等[20]通過尾靜脈注入過表達Akt的MSCs所釋放的外泌體(Akt-Exo)于大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Akt-Exo中血小板衍生生長因子-D(PDGF-D)的表達顯著上調(diào)，并促進體內(nèi)內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成以及血管生成，顯著改善心臟功能。這表明Akt-Exo介導(dǎo)的促血管生成是心肌修復(fù)過程中的一個重要機制。

缺氧對于MSCs來源外泌的釋放以及血管生成具有促進作用。Zhang等[21]在缺氧條件下培養(yǎng)的人臍帶MSCs，可釋放含有mRNA和miRNA的外泌體，將其轉(zhuǎn)移到靶細胞后可促進臍帶血管內(nèi)皮細胞增殖，并伴隨血管生成、血流恢復(fù)和毛細血管網(wǎng)形成。Bian等[22]同樣也在缺氧條件下培養(yǎng)MSCs，其釋放的MVs(主要成分為外泌體)可被體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞迅速吸收，促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成，并具有劑量依賴性；并且在心肌梗死小鼠模型中，心肌注射MSCs 來源外泌體可顯著改善血流恢復(fù)。Kang等[23～25]發(fā)現(xiàn)ASCs釋放的MVs有助于人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的遷移和血管腔結(jié)構(gòu)形成，并進一步證實ASCs-MVs 中miR-31的上調(diào)可靶向抑制內(nèi)皮細胞中的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)，對新生血管的形成具有促進作用。因此，缺氧預(yù)處理對于MSCs來源外泌體在促進血管生成中有積極的作用?？赡苁且驗榈脱鯒l件能使MSCs發(fā)揮更好的生物活性，釋放更多功能性外泌體，并且更好地促進血管的生成以發(fā)揮組織修復(fù)作用。

雖然MSCs來源外泌體可通過促進血管生成的方式來提供血流灌注，從而對心肌和血管起到保護作用，但并沒有確切的證據(jù)證明MSCs可通過分泌外泌體起心臟再生的作用，對心肌細胞的增殖和遷移并沒有明顯的影響。目前發(fā)現(xiàn)的MSCs來源外泌體在內(nèi)皮細胞中激活血管生成的相關(guān)機制可能與其促進心臟再生有一定的關(guān)聯(lián)，但相對于內(nèi)皮細胞，功能性心肌細胞的增殖和再生的過程更加困難。 因為功能性心肌細胞不像內(nèi)皮細胞，可容易地遷移到病變區(qū)域進行增殖；此外，單獨的生物制劑不一定能促進心肌細胞的再生，因為定居在心臟中的心臟干細胞幾乎是微乎其微。但有研究發(fā)現(xiàn)，心肌祖細胞(CPCs)釋放的外泌體除了能促進內(nèi)皮細胞的遷移和VEGF的分泌導(dǎo)致的血管生成，還能誘導(dǎo)心臟再生；并且不管是應(yīng)用外泌體還是細胞移植，相對于MSCs或CPCs的單獨應(yīng)用，MSCs和CPCs的聯(lián)合對梗死面積的減少和心臟功能的改善有更好的療效[26]。聯(lián)合MSCs來源外泌體和MSCs的定向移植可能會發(fā)揮更好的修復(fù)和再生作用，因為移植MSCs可確保細胞的來源，而外泌體則發(fā)揮促進MSCs定向分化為功能性心肌細胞的功能。

綜上所述，MSCs來源外泌體對心血管系統(tǒng)發(fā)揮的抗心肌細胞凋亡、抗血管重構(gòu)、抗炎癥和組織修復(fù)等作用，是間充質(zhì)干細胞療法中潛在的新機制。將MSCs來源外泌體中的生物活性物質(zhì)準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)運到靶位點上是目前面臨的一個重大挑戰(zhàn)，并且外泌體作為生物制劑并不能發(fā)揮細胞的完整功能，只能在分子水平上行使其對心肌和血管的保護作用。MSCs來源外泌體并不能完全替代MSCs細胞移植而最大程度的修復(fù)受損的心肌。聯(lián)合MSCs移植和MSCs來源外泌體的相關(guān)療法對心血管疾病的治療將有重大進展。因此，需要開發(fā)更先進的細胞靶向移植技術(shù)，將供體細胞準(zhǔn)確地機械整合到受體組織中，并與受體心肌組織完美耦聯(lián)，以實現(xiàn)協(xié)調(diào)的心臟功能。

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