喬曉霞，謝英彬，張潔，檀艷麗，孫彤彤，方川

(1河北大學(xué)，保定 071000；2河北大學(xué)附屬醫(yī)院)

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見的原發(fā)性腦腫瘤，經(jīng)積極治療后預(yù)后差，生存期短，復(fù)發(fā)率高。酸性神經(jīng)酰胺酶(ASAH1)是細(xì)胞膜重要組成部分神經(jīng)鞘脂代謝平衡系統(tǒng)中的重要酶，參與細(xì)胞增殖與凋亡，其在人體各類腫瘤中的重要作用也逐步被關(guān)注及研究[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是重要細(xì)胞因子，它廣泛參與并具有調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞凋亡、增殖和分化等功能[2,3]。Caspase家族是調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的酶類，其中半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)是細(xì)胞早期凋亡過程中重要的效應(yīng)分子[4]。在腦膠質(zhì)瘤中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白的表達(dá)情況及相關(guān)性國內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此，本研究觀察了腦膠質(zhì)瘤組織中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表達(dá)變化，并分析三種蛋白的相關(guān)性，旨在為臨床上腦膠質(zhì)瘤的診療及預(yù)后評估提供新的分子標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2016年12月河北大學(xué)附屬醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者70例，男36例，女34例；年齡16～67(48.89±12.94)歲；所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，且術(shù)前均未行抗腫瘤治療。按WHO膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分為低級別者(Ⅰ～Ⅱ級)32例、高級別者(Ⅲ～Ⅳ級)38例。手術(shù)切取腦膠質(zhì)瘤及癌旁組織各70例份，分別計(jì)為觀察組和對照組。

1.2 組織ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白檢測方法 采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片為陽性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ASAH1陽性表達(dá)于胞質(zhì)，TGF-β1、Caspase-3陽性大部分表達(dá)于胞質(zhì)、偶見于胞核，均以棕黃色顆粒特異性分布于胞質(zhì)或胞核者視為陽性。由2名病理醫(yī)師分別獨(dú)立執(zhí)行，采用雙盲法閱片，采用Krajewska描述的方法對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞占0～4%計(jì)0分，5%～24%計(jì)1分，25%～49%計(jì)2分，50%～74%計(jì)3分，75%～100%計(jì)4分。免疫組化染色指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)×染色強(qiáng)度，染色指數(shù)0判為陰性(-)，1～2判為弱陽性(+)，3～4判為中等陽性(++)，4以上判為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用秩和檢驗(yàn)檢測低、高級別腦膠質(zhì)瘤組織中蛋白的表達(dá)差異，采用Spearman相關(guān)性分析三種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，總體生存分析的比較用Breslow檢驗(yàn)并繪制Kaplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白陽性率比較 觀察組ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白陽性率分別為81.42%、87.14%、75.71%，對照組分別為16.67%、33.33%、25.00%，兩組比較，P均<0.05。觀察組低、高級別者ASAH1蛋白陽性率分別為68.75%、92.10%，TGF-β1蛋白陽性率分別為81.25%、92.10%，Caspase-3蛋白陽性率分別為87.50%、65.79%，兩者比較，P均<0.05。

2.2 觀察組ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性與陰性者生存時(shí)間比較 對受試者進(jìn)行6個(gè)月～3年隨訪，平均(19.40±8.52)個(gè)月。ASAH1蛋白表達(dá)陽性者(57例)與陰性者(13例)中位生存時(shí)間分別為10、23個(gè)月，TGF-β1蛋白表達(dá)陽性者(61例)與陰性者(9例)中位生存時(shí)間分別為10、20個(gè)月，Caspase-3表達(dá)陽性者(53例)與陰性者(17例)中位生存時(shí)間分別為13個(gè)月、6個(gè)月，兩者比較，P均<0.05。

2.3 觀察組ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 觀察組ASAH1蛋白與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.652，P<0.05)，ASAH1、TGF-β1與Caspase-3表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.427、-0.317，P均<0.05)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是惡性程度高、侵襲性強(qiáng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，臨床手術(shù)治療輔以放化療的綜合性治療是主要的治療手段，但目前預(yù)后仍然很差，生存期短。腦膠質(zhì)瘤治療不成功的原因通常是因?yàn)樵\斷較晚，缺乏特異性診斷標(biāo)記物，或是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高增值及侵襲的特性[5]。故從分子角度尋求新治療方法的必要性大大增加。

ASAH1能將神經(jīng)酰胺(Cer)催化水解為神經(jīng)鞘氨醇(SPH)，SPH進(jìn)一步磷酸化生成1磷酸神經(jīng)鞘氨醇(S1P)，ASAH1通過調(diào)控Cer、SPH、S1P三種物質(zhì)的平衡，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、存活、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)[6]。ASAH1被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等多種人類腫瘤中過表達(dá)，參與增殖、凋亡、侵襲、耐藥等生物效應(yīng)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7,8]。Vejselova等[9]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用ASAH1抑制劑ceranib-2后，乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖能力下降，在敲除了黑色素瘤細(xì)胞中ASAH1基因后，細(xì)胞生長周期受到抑制，凋亡加速[10]。Mescic等[11]發(fā)現(xiàn)，C-5-炔基尿嘧啶衍生物可通干擾ASAH1活性來擾亂ASAH1介導(dǎo)的鞘脂信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。研究[12～14]證實(shí)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞中ASAH1表達(dá)升高，導(dǎo)致下游產(chǎn)物S1P富集，使腫瘤微環(huán)境更適合GBM細(xì)胞生長，S1P還能上調(diào)GBM細(xì)胞尿激酶纖溶酶原激動(dòng)劑及其受體，同時(shí)增強(qiáng)侵襲性的分子MMP表達(dá)，提高GBM細(xì)胞侵襲力。Doan等[12,15]還發(fā)現(xiàn)，ASAH1高表達(dá)的GBM對放療明顯抵抗，在應(yīng)用了ASAH1抑制劑卡莫氟或特異性抗體后，腫瘤細(xì)胞對放療敏感性顯著升高，放療后細(xì)胞凋亡顯著增加。然而，ASAH1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明。

TGF-β1是由多種細(xì)胞包括免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞甚至腫瘤細(xì)胞分泌的多功能組織因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和組織穩(wěn)態(tài)等多種功能[16]，目前被認(rèn)為是重要的致癌因子。在神經(jīng)鞘磷脂代謝中，TGF-β1不僅可通過ALK5/Smad2途徑增加ASAH1的表達(dá)和活躍度[17]促進(jìn)Cer分解成SPH，也可進(jìn)一步上調(diào)SPH激酶的表達(dá)活性，從而抑制細(xì)胞凋亡[18,19]，生成的底物S1P也能能促進(jìn)血管生成[20]。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤組織中TGF-β1的表達(dá)與微血管密度密切相關(guān)。但在腦膠質(zhì)瘤組織中，TGF-β1是否也能調(diào)控ASAH1發(fā)揮相關(guān)作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)未見詳細(xì)報(bào)道。

Caspase-3是細(xì)胞早期凋亡效應(yīng)分子，在凋亡過程中都能起關(guān)鍵作用[22]。ASAH1是水解Cer的關(guān)鍵酶，神經(jīng)酰胺通過激活外源性死亡受體通路，進(jìn)而激活Caspase-3和一系列的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步激活Caspase-9、Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]。Azuma等[25]發(fā)現(xiàn)，ASAH1過表達(dá)可使Caspase-3 mRNA水平降低，提示ASAH1可能對Caspase-3通路有直接抑制作用。Kim等[26]也發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中加入TGF-β1后能明顯抑制活性Caspase-3的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。在腦膠質(zhì)瘤中ASAH1、TGF-β1是否對Caspase-3有抑制作用，并未被證實(shí)。

本研究顯示，觀察組ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白陽性率均高于對照組；觀察組低級別者ASAH1、TGF-β1蛋白陽性率低于高級別者，低級別者Caspase-3蛋白陽性率高于高級別者；ASAH1、TGF-β1蛋白表達(dá)陽性者中位生存時(shí)間短于陰性者，Caspase-3表達(dá)陽性者中位生存時(shí)間長于陰性者；觀察組ASAH1蛋白與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)，ASAH1、TGF-β1與Caspase-3表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。提示腦膠質(zhì)瘤組織中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，檢測上述蛋白有助于此病病情判斷及預(yù)后評估。

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