張夢(mèng)瑤，巨安慶，楊 峰，劉開(kāi)東，王國(guó)義，柳 楠，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東青島 266121；3.赤峰市敖漢旗種羊場(chǎng)，內(nèi)蒙古赤峰 024300）

大多數(shù)綿羊表現(xiàn)為季節(jié)性發(fā)情，通常在光照逐漸縮短的夏末秋初發(fā)情。哺乳動(dòng)物的發(fā)情是一個(gè)多級(jí)的生理過(guò)程，包括發(fā)情初期的卵泡生長(zhǎng)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂及卵泡破裂黃體化。目前關(guān)于家畜季節(jié)性發(fā)情的啟動(dòng)機(jī)制研究較少，大多數(shù)集中在激素水平的變化，如垂體分泌的促性腺激素、促卵泡激素及促黃體激素[1]等，而基因作用機(jī)制尚不清楚。因此尋找綿羊季節(jié)性發(fā)情的調(diào)控基因，對(duì)于提高綿羊的繁殖效率促進(jìn)育種進(jìn)程有重要意義。

促凋亡基因BAD屬于Bcl-2大家族[2]。細(xì)胞凋亡是受Bcl-2家族中促進(jìn)和抑制細(xì)胞2類(lèi)蛋白的比例決定，Bcl-2家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bcl-2家族包括凋亡抑制基因bcl-2、mcy-1、bcl-xl等，凋亡基因BAD、bcl-xs、bax等和僅存在BH-3結(jié)構(gòu)域的基因bim、bik、bid等[3-4]。大量研究表明[5-6]，Bcl-2家族基因的表達(dá)產(chǎn)物也在線粒體調(diào)節(jié)的凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用。Zong等[7]和李東侃等[8]發(fā)現(xiàn)，BAD基因在眼球萎縮眼視神經(jīng)殘存髓鞘組織以及正常的視神經(jīng)髓鞘組織有表達(dá)，而在束間隔及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)，表明BAD可能具有促進(jìn)外傷性眼球萎縮的功能。RangEr等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺少BAD蛋白的小鼠會(huì)發(fā)生腫瘤細(xì)胞的增殖，而且絕大多數(shù)為B淋巴細(xì)胞瘤，這說(shuō)明BAD是一種抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白。

敖漢細(xì)毛羊是內(nèi)蒙優(yōu)良肉毛兼用型綿羊品種，表現(xiàn)為季節(jié)性發(fā)情，在夏末秋初開(kāi)始發(fā)情[10]。本研究擬利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BAD基因在乏情期、發(fā)情前期、發(fā)情間期以及發(fā)情期卵巢中BAD基因的表達(dá)情況，利用放射免疫方法測(cè)定了血液中促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）和孕激素（P4）的濃度，分析其與敖漢細(xì)毛羊季節(jié)性發(fā)情啟動(dòng)的關(guān)系，為深入研究綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)理機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選擇飼養(yǎng)條件一致、體重接近、3～4周歲、空懷的健康敖漢細(xì)毛羊母羊24只，分為乏情期、發(fā)情間期、發(fā)情前期和發(fā)情期4組，每組6只羊。每只羊以發(fā)情開(kāi)始到第2次發(fā)情開(kāi)始作為其發(fā)情周期，分別在夏季的乏情期和秋季的發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情間期4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死細(xì)毛羊，并在最短時(shí)間內(nèi)用專(zhuān)門(mén)處理過(guò)的、潔凈的手術(shù)器械采集卵巢組織，立即放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、DEPC、DAPI等均購(gòu)自青島賽尚科貿(mào)有限公司；iTaq-Uniwersal SYBR Green SuPermix 5 mL（5×1mL Vials）購(gòu) 自Bio-Rad公 司；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、DNA Ladder 2000、Dream TaqTM Green PCR Master Mix2×均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。核酸蛋白分析儀購(gòu)自德國(guó)EppEndorf公司；EDC-810PCR儀購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-11型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；Redbio CFX ConnectTM熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 血清采集 在乏情季節(jié)血液采集17 d；在發(fā)情季節(jié)從第1次發(fā)情開(kāi)始采集血液，直至下一次發(fā)情開(kāi)始結(jié)束。在8:00和14:00各采集不抗凝血各1次，每次10 mL。采集后血液37℃ 靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清于干凈的1.5 mL離心管中，置于-20℃的冰箱保存，備用。送至青島擎科生物采用放射免疫法測(cè)定血清中的P4、E2、LH和FSH濃度。

1.4 卵巢中RNA的提取及cDNA的合成 選取乏情期和發(fā)情期卵巢組織樣品60 mg，加入1 mL的TRN-zol Roche試劑粉碎勻漿后抽提RNA。使用BioPhotometer型核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，將檢驗(yàn)合格的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)綿羊BAD基因（GenBank登錄號(hào)：XM-004019650.3）和綿羊GAPDH（GenBank登錄號(hào)：NM-001190390）的序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由青島擎科生物有限公司合成，引物的基本信息見(jiàn)表1。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板cDNA 1 μL，金牌Green mix 22 μL，上、下游引物各 1 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用2-△△CT值法計(jì)算各樣本中BAD相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 17.0軟件中t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 引物信息

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增 1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示，引物擴(kuò)增的條帶單一，內(nèi)參基因產(chǎn)物大小為125 bp ，目的基因產(chǎn)物大小為257 bp，與已知的目的基因大小一致，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 GAPDH（A）和BAD（B）擴(kuò)增

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 由圖2可知，BAD和GAPDH基因熔解曲線峰值單一、無(wú)雜峰，可知引物設(shè)計(jì)特異性良好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 BAD基因和GAPDH基因熒光定量擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）

2.3BAD基因的相對(duì)表達(dá)量 如圖3所示，BAD基因在發(fā)情前期的表達(dá)量極顯著高于乏情期、發(fā)情期和發(fā)情間期（P＜0.01）；在發(fā)情期的表達(dá)量極顯著高于乏情期和發(fā)情間期（P＜0.01）；乏情期和發(fā)情間期的表達(dá)量基本相同（P＞0.05）。

2.4 4種生殖激素在發(fā)情周期中的變化規(guī)律 由表2可知，E2濃度在第1、2 、16、17天 極顯著高于其他時(shí)間（P＜0.01），LH濃度在第1 天和第17 天極顯著高于其他時(shí)間（P＜0.01）；P4濃度在發(fā)情間期處于較高的水平，第5～15天濃度極顯著高于其他時(shí)間（P＜0.01），P4濃度在發(fā)情期處于發(fā)情季節(jié)的最低值；FSH濃度在發(fā)情后降低，在發(fā)情間期逐漸升高，在第5～13天濃度極顯著高于其他時(shí)間（P＜0.01），在發(fā)情期時(shí)處于較高的水平。

圖3 各個(gè)時(shí)期BAD基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5BAD基因在不同發(fā)情時(shí)期的表達(dá)量與4種激素濃度變化的分析 由圖4可知，E2含量隨著B(niǎo)AD基因表達(dá)量的升高而升高，推斷BAD基因?qū)2的分泌均有促進(jìn)作用。由圖5可知，LH的含量隨著B(niǎo)AD基因表達(dá)量的升高而升高，推斷BAD基因?qū)H的分泌均有促進(jìn)作用。由圖6可知，P4濃度含量隨著B(niǎo)AD基因表達(dá)量的升高而降低，從而推斷BAD基因在發(fā)情季節(jié)的表達(dá)對(duì)P4分泌有抑制作用。由圖7可知，F(xiàn)SH的濃度變化沒(méi)有相應(yīng)的促進(jìn)和抑制規(guī)律變化關(guān)系，從而推斷BAD基因的表達(dá)與FSH濃度的變化沒(méi)有相應(yīng)關(guān)系。

圖4 E2濃度與BAD基因相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

BAD基因是與卵泡閉鎖相關(guān)的促凋亡因子。王龍濤等[11]對(duì)BAD基因在小尾寒羊和薩福克羊卵巢、輸卵管和子宮中的定位進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，BAD基因在原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡呈現(xiàn)中度著染，而在3級(jí)卵泡中呈輕度著染；在小尾寒羊和薩?？搜蚵雅萜谥蠦AD基因在卵巢卵泡、輸卵管以及子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，提示BAD基因的表達(dá)參與母羊生殖器官細(xì)胞凋亡的調(diào)控。BAD基因在小尾寒羊和薩?？搜蛏称鞴僦斜磉_(dá)有顯著的差異[12]，提示BAD基因在母羊生殖器官中的表達(dá)對(duì)于調(diào)控生殖器官細(xì)胞凋亡以及對(duì)母羊繁殖力有某種程度的影響，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，BAD基因在發(fā)情前期的表達(dá)量極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期，這與前期相關(guān)研究結(jié)果一致，另一方面推測(cè)出BAD基因是與卵泡閉鎖相關(guān)的促凋亡因子。

表2 敖漢細(xì)毛羊發(fā)情周期4種激素濃度

圖5 LH濃度與BAD基因相對(duì)表達(dá)量

圖6 P4濃度與BAD基因相對(duì)表達(dá)量

圖7 FSH濃度與BAD基因相對(duì)表達(dá)量

綿羊的發(fā)情周期一般為16.5（14～20）d，本實(shí)驗(yàn)中的敖漢細(xì)毛羊發(fā)情周期為17 d。在發(fā)情前期，由于受FSH影響，卵泡開(kāi)始明顯生長(zhǎng)，產(chǎn)生的E2增加，使得輸卵管內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)及其微絨毛增長(zhǎng)，黏膜慢慢變厚。本研究中E2濃度在第1 天和第2 天的濃度顯著高于其他時(shí)間段，與理論相符合，主要在動(dòng)物的初情期前促進(jìn)第二性征發(fā)育和垂體以及下丘腦有關(guān)生殖內(nèi)分泌的活動(dòng)。LH對(duì)維持黃體功能具有重要作用，發(fā)情后期也叫后情期，發(fā)情期之后，動(dòng)物在LH作用下黃體迅速地發(fā)育。LH與FSH都是由腺垂體分泌，同屬糖蛋白激素[13]，在FSH的協(xié)同作用下促進(jìn)雌性動(dòng)物的卵泡成熟和排卵，使得排卵后的顆?；?xì)胞黃體化。在發(fā)情的第14天綿羊會(huì)進(jìn)入卵泡期，這個(gè)時(shí)期FSH分泌激增，從而產(chǎn)生了排卵之前FSH高峰值，P4濃度會(huì)迅速下降，伴隨著黃體的逐漸退化，同時(shí)E2的濃度會(huì)伴隨著P4下降而快速升高，出現(xiàn)于LH峰平行的E2峰。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LH濃度在發(fā)情前期和發(fā)情后期顯著高于其他時(shí)期，這與LH的生理功能作用相一致，在后期促進(jìn)黃體的發(fā)育。同樣FSH在間期分泌增加協(xié)同LH來(lái)促進(jìn)卵泡的成熟和排卵，在動(dòng)物的發(fā)情中扮演著重要的角色。在發(fā)情周期中，P4的分泌量濃度變化與黃體的生長(zhǎng)發(fā)育保持一致，在第8天的時(shí)候P4的分泌量達(dá)到最高水平，在發(fā)情前期開(kāi)始下降。趙偉等[14]在對(duì)波爾山羊的研究中發(fā)現(xiàn)，P4在發(fā)情的第7天明顯上升，到達(dá)第11天的時(shí)達(dá)到最大值，之后分泌量逐漸降低。從整體上來(lái)看，綿羊在黃體期的外周血中P4濃度處于比較高的水平；本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，P4在發(fā)情間期處于較高的水平，發(fā)情期濃度較低。

近期研究表明黃體的退化受細(xì)胞凋亡調(diào)控。盧璐璐等[15]通過(guò)沉默卵泡顆粒細(xì)胞中BAD基因，運(yùn)用放射免疫法得到P4會(huì)隨著B(niǎo)AD基因的表達(dá)下降而極顯著升高，E2的分泌量也有所下降但差異不顯著。推測(cè)BAD基因可能通過(guò)調(diào)控P4的分泌量來(lái)控制綿羊的發(fā)情啟動(dòng)和維持發(fā)情[16]。葛晨霞等[17]研究表明，黃體的退化可能需要BAD基因參與，BAD基因的表達(dá)可能受到P4濃度的影響。通過(guò)對(duì)小鼠輸卵管中BAD基因的研究發(fā)現(xiàn)，其在發(fā)情間期的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而在發(fā)情期則逐漸降低，會(huì)隨著發(fā)情不同階段的變化而變化，與動(dòng)物的發(fā)情啟動(dòng)密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，P4在發(fā)情間期保持較高濃度，后隨著B(niǎo)AD基因表達(dá)量的升高而顯著降低。E2的分泌量隨著B(niǎo)AD基因表達(dá)量的升高而升高，本實(shí)驗(yàn)與相關(guān)報(bào)道一致，從而推出BAD基因的表達(dá)對(duì)E2、P4的分泌有相應(yīng)的促進(jìn)和抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情前期BAD基因的表達(dá)量極顯著高于乏情期、發(fā)情期和發(fā)情間期；發(fā)情期的表達(dá)量極顯著高于乏情期和發(fā)情間期；乏情期和發(fā)情間期的表達(dá)量基本相同，沒(méi)有顯著性差異。在沉默卵泡顆粒細(xì)胞中BAD基因的情況下，運(yùn)用放射免疫法得到結(jié)果顯示，P4會(huì)隨著B(niǎo)AD基因的表達(dá)下降而極顯著升高；E2的分泌量也有所升高但是差異不顯著，反向驗(yàn)證了BAD基因抑制P4的表達(dá)[14]。P4的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，P4會(huì)隨著B(niǎo)AD基因的表達(dá)升高而極顯著降低。但本實(shí)驗(yàn)中E2的分泌量也隨著B(niǎo)AD基因的表達(dá)升高而顯著升高，這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種差異有關(guān)；FSH濃度與BAD基因的表達(dá)沒(méi)有直接的相關(guān)性。綜上結(jié)果表明，BAD基因的表達(dá)對(duì)卵巢的成熟起到了一定的促進(jìn)作用，同時(shí)也影響了生殖激素的分泌，從而得出基因的表達(dá)對(duì)綿羊的發(fā)情有一定的控制作用。

4 結(jié) 論

BAD基因在發(fā)情前期的表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)期；E2和LH濃度在BAD基因表達(dá)量最高的發(fā)情前期維持在較高水平，P4的濃度維持較低水平，推斷BAD基因的表達(dá)對(duì)卵泡的成熟起促進(jìn)作用，同時(shí)也促進(jìn)了E2和LH的分泌，抑制了P4的產(chǎn)生，進(jìn)而影響細(xì)毛羊發(fā)情。

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