黃玲玲，黃小紅，陳 黎，盧立志*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310023）

基因編輯技術(shù)是生物科學(xué)研究的一種非常重要的工具，基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)開啟了生物基因人工修飾的大門。鋅指樣核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription Activator-Like Effectors Nucleases，TALEN）技術(shù)分別作為第1代和第2代核酸內(nèi)切酶，已被廣泛地用于基因組定點(diǎn)修飾功能。CRISPR/cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-Associated Proteins）是繼二者之后出現(xiàn)的一種新的基因組靶向修飾技術(shù)，CRISPRs 最先引起科學(xué)界的注意是其存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌間隔排列的串聯(lián)重復(fù)序列（CRISPRs），其轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物crRNA（CRISPR-derived RNA）與CRISPR相關(guān)蛋白特異性抑制外來質(zhì)?；蚴删w侵入，具有精確抵御外源入侵的作用，后來被證明是一種獲得性免疫系統(tǒng)[1]。作為最新發(fā)展起來的基因編輯技術(shù)，CRISPR/cas因其簡(jiǎn)單、方便、高效的特點(diǎn)正被廣泛運(yùn)用于基因治療、基因功能研究和建立與人類疾病相關(guān)的動(dòng)物模型等方面的研究。近年來隨著CRISPR系統(tǒng)技術(shù)不斷被深入開發(fā)，一些新效應(yīng)蛋白被發(fā)現(xiàn)，本文就CRISPR/cas系統(tǒng)分類、原理及新效應(yīng)蛋白發(fā)現(xiàn)和cas9（S. Pyogenes）多種變構(gòu)體技術(shù)開發(fā)研究進(jìn)展及在家禽上的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 CRISPR 系統(tǒng)分類及作用機(jī)制

1.1 CRISPR系統(tǒng)分類 根據(jù)cas基因的組成和效應(yīng)蛋白的種類，CRISPR系統(tǒng)被分為了2 類 6型，超過19個(gè)亞型[2-4]（圖1）。Class 1為用多個(gè)效應(yīng)蛋白復(fù)合物干擾靶基因的CRISPR/cas 系統(tǒng)，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；Class 2為用單一效應(yīng)蛋白干擾靶基因的CRISPR/cas系統(tǒng)，包括Ⅱ、Ⅴ和VI型。

Ⅰ型系統(tǒng)包括6 種不同亞型，系統(tǒng)特征性蛋白是cas3 蛋白，它包含1個(gè) HD水解酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)類DExH 解旋酶結(jié)構(gòu)域，所有亞型均編碼crRNA引導(dǎo)復(fù)合物 Cascade（CRISPR-Associated Complex for Antiviral Defe nse），包括cas1、cas2、cas3等多個(gè)蛋白的復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物具有RNA核酸內(nèi)切酶活性，參與precrRNA轉(zhuǎn)錄過程；Type III系統(tǒng)特異性蛋白cas10，其具有RNA內(nèi)切酶蛋白活性，與TypeⅠCascade功能相似，參與crRNA的剪切和成熟，包括 Type III-A csm和 Type III-B cmr 2種類型，既可以靶標(biāo)DNA，又可以靶標(biāo)RNA；Ⅳ型缺少cas1、cas2蛋白，替代的多效應(yīng)蛋白復(fù)合物有cas5、cas7、csf1蛋白，csf1是該系統(tǒng)的特征性蛋白，根據(jù)是否有解旋酶DinG可以分為2種亞型[5-7]。

Class2 類較Class 1類系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單、清楚。CRISPR/cas9為 Class2 Ⅱ 型 系 統(tǒng)，cas9 包 含 RuvC和 HNH（His-Asn-His domain）2個(gè) 結(jié) 合 域， 切 割位點(diǎn)鄰近c(diǎn)rRNA互補(bǔ)序列下游的原間隔區(qū)相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），其中HNH切割與 crRNA 互補(bǔ)的DNA鏈，而RuvC切割非互補(bǔ)鏈，產(chǎn)生平末端雙鏈切口（Double Stand Break，DSB）。Ⅴ型包括RuvC以及核酸內(nèi)切酶結(jié)合域（Nuc）構(gòu)成的效應(yīng)蛋白cas12a、cas12b、cas12c，產(chǎn)生粘性末端雙鏈切口，該型在pre-crRNA加工過程對(duì)tracrRNA需求不同[8-9]。VI包 括 2個(gè) HEPN（Higher Eukaryote and Prokaryote Nucleotide-Binding）結(jié)合域，具有RNA核酸內(nèi)切酶活力，介導(dǎo)靶向RNA編輯系統(tǒng)，由crRNA互補(bǔ)配對(duì)的ssRNA活化HEPN結(jié)合域，引導(dǎo)非序列特異性剪切[10]。

1.2 CRISPR作用機(jī)制 無論哪種類型的CRISPR系統(tǒng)，其抵御外源遺傳物質(zhì)的防御過程原理都大致相同，以目前研究最為清楚的 CRISPR/cas9 系統(tǒng)為例（圖2）：在整合階段，CRISPR 系統(tǒng)會(huì)捕捉噬菌體或外源的DNA，以cas9識(shí)別PAM（NGG）序列作為挑選間隔序列的條件，由cas1、cas2及Ⅱ型其他因子介導(dǎo)將間隔序列整合到CRISPR中的重復(fù)序列之間；在組裝階段，間隔序列轉(zhuǎn)錄形成pre-CrRNA在cas9與RNaseⅢ及其他因子作用下，與反向激活crRNA（Trans-Activating crRNA，tracrRNA）互補(bǔ)配對(duì)組裝形成crRNA-tracRNA-Cas9復(fù)合物；在干擾階段，識(shí)別后準(zhǔn)確地切除或降解靶定的序列，這個(gè)過程由RNA-蛋白酶復(fù)合物執(zhí)行，crRNA識(shí)別與其堿基互補(bǔ)配對(duì)序列，cas9將其進(jìn)行切割，造成雙鏈斷裂，激活細(xì)胞的非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）或同源重組（Homologous Recombination，HR）2種修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因的插入或缺失[11]。

2 CRISPR新型效應(yīng)蛋白

2.1 RNase活性的Lshc2c2、Fncas9 隨著對(duì)細(xì)菌免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)機(jī)制研究的深入，Type II （Fncas9）和Type VI（c2c2）被發(fā)現(xiàn)具有切割RNA鏈活性的功能，拓寬了CRISPR系統(tǒng)靶向范圍。c2c2在細(xì)菌Leptotrichia shahii被發(fā)現(xiàn)，識(shí)別位點(diǎn)是3′端原間隔序列單核苷酸（PFS）A、U、C，它在ssRNA結(jié)合位點(diǎn)外的不同距離上剪切ssRNA。至今，c2c2還未應(yīng)用于真核生物細(xì)胞中[10]。另一個(gè)具有相似RNA序列識(shí)別功能的核酸內(nèi)切酶Fncas9（Francisella novicida）于2013年被發(fā)現(xiàn) ，2015年被運(yùn)用于抑制人肝癌細(xì)胞中丙型肝炎病毒HCV（Hepatitis C Virus）的增殖，Price等[13]設(shè)計(jì)了rg RNA（RNA-Targeting Guide RNA ）靶定HCV正負(fù)義鏈 5′、3′UTR區(qū)，抑制RNA病毒基因復(fù)制和蛋白翻譯來抑制病毒在細(xì)胞上的增殖，令人驚奇的是點(diǎn)突變?cè)贔ncas9 的Ruv C 和HNH 功能域激活位點(diǎn)（D11A 和H969A），并沒有降低抑制HCV病毒效率，而點(diǎn)突變?cè)诟缓彼嵝蛄蠥RM（Arginine-Rich Motif）R59A位點(diǎn)（cas9與crRNA相互結(jié)合作用），顯著降低了抑制HCV病毒效率，表明Fncas9系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA引導(dǎo)RNA序列剪切作用的機(jī)理值得更深入的研究。

圖1 CRISPR/cas 系統(tǒng)分類[3,11]

圖2 自然環(huán)境下抵御外源遺傳物質(zhì)的防御原理（CRISPR/cas9）[12]

2.2 小分子效應(yīng)蛋白 近年發(fā)現(xiàn)，與cas9同源形式的Staphylococcus aureus（Sacas9）、Streptococcus thermophilus（St1cas9）和Neisseria meningitidis（Nmcas9），分子量分別為3.2、3.4、3.2 kb，比Spcas9（4.2 kb）較小，同屬于Type II免疫系統(tǒng)。由于Spcas9蛋白較大，運(yùn)轉(zhuǎn)到真核生物上有時(shí)候需要包裝成病毒，而小分子效應(yīng)蛋白更容易被轉(zhuǎn)運(yùn)到生物體內(nèi)，這些cas9同源效應(yīng)蛋白較Spcas9需要更長(zhǎng)的PAM （間隔序列臨近基序），縮小靶點(diǎn)范圍，但也減少了脫靶位點(diǎn)數(shù)量[14-16]。

2015年張鋒小組發(fā)現(xiàn)的 CRISPR/ cpf1 屬于 2 類Ⅴ型系統(tǒng)，包括Francisella novicida（Fncpf1）、Acidaminococcus（Ascpf1）、Lachnospiraceae bacterium（Lbcpf1），而cpf1 效應(yīng)蛋白同時(shí)具DNA和RNA內(nèi)切酶活性，因此初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA由cpf1自身加工，不需要tracrRNA的參與，cpf1剪切DNA所需的crRNA長(zhǎng)度僅為42～44 nt，只需替換CRISPR 中的間隔序列就可以靶定不同基因，cpf1的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了CRISPR系統(tǒng)基因組編輯的靶點(diǎn)范圍，尤其是富含AT的基因組[17-18]。

3 Spcas9各種變構(gòu)體

3.1 提高特異性變構(gòu)體 Spcas9-nickase單切口酶是一種Spcas9變體，通過突變其中1個(gè)催化亞基HNH或RuvC形成的效應(yīng)物，而dSpcas9是Spcas9 2個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC的D10A位點(diǎn)和HNH的H840A 位點(diǎn)同時(shí)突變形成的新變體，有RNA介導(dǎo)DNA結(jié)合能力而無內(nèi)切酶活性，用熒光或其他蛋白標(biāo)簽標(biāo)記，可用于活體DNA成像，該變體與FokI核酸酶融合，形成FokI-dcas9，降低脫靶概率，提高準(zhǔn)確性[19]。Spcas9-CD是dSpcas9酶N端與胞苷脫氨酶融合形成新變體，這個(gè)變體直接介導(dǎo)C轉(zhuǎn)變U，在DNA復(fù)制期間，A結(jié)合U，T結(jié)合A，最后導(dǎo)致 C-T（或G-A）轉(zhuǎn)變，是一個(gè)堿基編輯工具。Komor等[20]在體內(nèi)外驗(yàn)證了BE3（APOBEC-XTEN-dcas9）的堿基特異性編輯效率比Spcas9通過HDR介導(dǎo)編輯效率高，并靶定載脂蛋白E（APOE4 ）在112和158位氨基酸堿基 C-T轉(zhuǎn)變，為治愈晚發(fā)性阿爾茨海默病提供可能，為未來基因治愈建立方法。Kleinstiverd等[21]開發(fā)了Spcas9-HF1，破壞Spcas9：sgRNA復(fù)合物與DNA結(jié)合位點(diǎn)（N497，R661，Q695，Q926），降低對(duì)非靶位點(diǎn)DNA剪切能力，提高Spcas9效應(yīng)蛋白在基因組水平上靶向特異性。

3.2 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控變構(gòu)體 dSpcas9可以融合適當(dāng)效應(yīng)域，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制（CRISPRa，CRISPRi）。Larson等[22]在大腸桿菌和人細(xì)胞上單獨(dú)利用dSpcas9，設(shè)計(jì)sgRNA靶定蛋白編碼區(qū)序列或UTR區(qū)，使dcas9-sgRNA復(fù)合物結(jié)合到DNA鏈上，阻止了RNA聚合酶（RNAP）靠近，阻止轉(zhuǎn)錄延伸，另設(shè)計(jì)sgRNA靶定在啟動(dòng)子RNAP結(jié)合位點(diǎn)（-35和-10）或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS），使dcas9-sgRNA復(fù)合物結(jié)合到起始位點(diǎn)，阻止RNAP或轉(zhuǎn)錄因子與DNA鏈結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始[29-31]。

Piatek等[23]將dSpcas9的C端與激活效應(yīng)域EDLL和TAL融合，靶定目標(biāo)基因啟動(dòng)子序列Bs3:uidA（即Bs3啟動(dòng)子啟動(dòng)uida報(bào)告基因）和PDS基因啟動(dòng)子，提高了uida/PDS在植物細(xì)胞表達(dá)水平，并融合dcas9與SRDX抑制效應(yīng)域得到dcas9:SRDX，靶定PDS基因啟動(dòng)子，均能有效地抑制PDS基因表達(dá)水平。Gilbert等[24]融合轉(zhuǎn)錄抑制域KRAB domain of Kox1得到dCas9-KRAB，并轉(zhuǎn)染至人HEK293細(xì)胞，抑制轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活域VP64和p65均不同程度激活了報(bào)告GFP基因在人HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

3.3 表觀調(diào)控變構(gòu)體 dSpcas9也可通過靶定基因序列甲基化來調(diào)控基因表達(dá)。Liu等[25]利用dspcas9 蛋白分別與Tet1及Dnmt3a融合建立了有效介導(dǎo)基因組去甲基化（dcas9-Tet1）和甲基化（dcas9-Dnmt3a）的方法，利用dcas9-Tet1介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞BDNF基因啟動(dòng)子 IV和MyoD基因增強(qiáng)子去甲基化，提高了BDNF/MyoD基因表達(dá)水平；利用dcas9-Dnmt3介導(dǎo)miR-290的CTCF錨定靶點(diǎn)甲基化，阻止招募CTCF因子結(jié)合成環(huán)，從而暴露了增強(qiáng)子，提高了臨近環(huán)Nlrp12基因表達(dá)水平。Vojta等[26]利用dcas9-Dnmt3a系統(tǒng)靶定BACH2和IL6ST基因啟動(dòng)子CpG 島使其甲基化，從而下調(diào)了這2個(gè)基因的表達(dá)水平，為研究這2個(gè)基因表達(dá)與炎癥性腸道疾病免疫球蛋白N端糖基化之間可能存在的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。Choudhury等[27]利用dcas9-Tet1系統(tǒng)介導(dǎo)BRCA1基因啟動(dòng)子去甲基化，上調(diào)BRCA1基因表達(dá)水平。有研究報(bào)道，沉默BRCA1基因會(huì)提高得十幾種類型癌癥的概率[28-30]，為未來治療癌癥提供可能。

4 CRISPR/cas在家禽上的應(yīng)用

4.1 發(fā)育模型建立 胚胎發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的生物過程，往往需要利用一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)進(jìn)行研究胚胎發(fā)育機(jī)制，與其他動(dòng)物模型相比，雞胚由于易于手術(shù)操作，具有來源方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用且可同時(shí)進(jìn)行大樣本實(shí)驗(yàn)觀察等優(yōu)點(diǎn)，一直是發(fā)育生物學(xué)研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，具有重要的?shí)驗(yàn)價(jià)值[31]。Véron等[32]利用CRISPR技術(shù)靶定轉(zhuǎn)錄因子PAX7（主要表達(dá)在早期胚胎神經(jīng)管背部細(xì)胞），利用Tet-on系統(tǒng)和Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，將表達(dá)cas9蛋白和2條靶向PAX7的sgRNA通過轉(zhuǎn)座酶整合到雞胚基因組中，加入多西環(huán)素TRE promoter啟動(dòng)cas9蛋白表達(dá)，得到大片段穩(wěn)定敲除PAX7基因的雞胚，為后續(xù)研究PAX7基因在胚胎發(fā)育過程中功能研究奠定基礎(chǔ)。

隨著對(duì)胚胎干細(xì)胞（ESC）分化機(jī)制的研究，人們發(fā)現(xiàn)更多調(diào)控ESC向原生殖細(xì)胞（PGC）分化的關(guān)鍵基因。Zuo等[33]通過CRISPR/cas9技術(shù)敲除C1EIS（Chromosome1 Expression in SSC）基因發(fā)現(xiàn)，視黃酸（Retinoic Acid，RA）誘導(dǎo)ESC向SSC分化過程中敲除組ESC表面標(biāo)記基因nanog和sox2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)組，相反精原干細(xì)胞SSC表面標(biāo)記基因integrina6和stm8表達(dá)量顯著低于對(duì)照組和過表達(dá)組，驗(yàn)證了C1EIS基因在雄性生殖細(xì)胞分化過程中起重要作用。

4.2 生產(chǎn)性狀改良 由于禽類多為卵生動(dòng)物，受精卵緊密結(jié)合于表面蛋黃，而且未受精的卵子也很難取出，因此禽類不可能像哺乳動(dòng)物那樣通過核移植獲得基因編輯個(gè)體，因此轉(zhuǎn)基因禽類的發(fā)展比較緩慢。Bai等[34]利用自己構(gòu)建的stCRISRP/cas9系統(tǒng)和SSA-RPG 雙報(bào)告載體系統(tǒng)，在DF-1細(xì)胞系上也成功地敲除了過氧化物酶體增生物激活受體（PPAR），線粒體ATP酶合成體ε亞基（ATP5E）和OVA基因，為后續(xù)應(yīng)用CRISPR改良性狀建立方法。Oishi等[35]利用CRISPR/cas9系統(tǒng)，借助嘌呤霉素及博來霉素富集高效敲除了卵清蛋白（OVA）和卵類黏蛋白（OVM）的雞PGC細(xì)胞，同時(shí)將敲除雞OVM基因的PGC細(xì)胞注射入雞胚的血管中，得到了精子是嵌合體的轉(zhuǎn)基因公雞。將此公雞的后代通過雜交獲得OVM基因敲除的純合體轉(zhuǎn)基因雞，這是首次利用CRISPR/cas9系統(tǒng)制備的轉(zhuǎn)基因雞。Caitlin等[36]利用CRISPR/cas9系統(tǒng)分別設(shè)計(jì)2條sgRNA靶定GFP（通過Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)整合外源GFP）和DMRT1基因（DMRT1定位在Z染色體上，之前研究報(bào)道表明與性別發(fā)育有關(guān)[37]），通過精子攜帶基因轉(zhuǎn)移SMGT（Sperm Mediated Gene Transfer）得到后代基因敲除雞，為生產(chǎn)改良性狀家禽提供思路。胡曼等[38]利用CRISPR/cas9技術(shù)敲除肌肉生成抑制素（Myostatin，MSTN）為未來改良畜禽瘦肉率、改善肉質(zhì)性狀奠定基礎(chǔ)。Kim等[39]利用CRISPR/cas9技術(shù)在鵪鶉成肌細(xì)胞上對(duì)MyoD基因進(jìn)行敲除，降低了MyoD基因的表達(dá)水平，研究MyoD在肌肉分化過程中的調(diào)控作用，深入了解肌肉增殖分化機(jī)制，為改善肉質(zhì)性狀作鋪墊。

5 結(jié) 語

目前，CRISPR/cas 系統(tǒng)相關(guān)的基因組編輯技術(shù)已被應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，包括基因功能研究、基因治療、疾病模式動(dòng)物的構(gòu)建及畜禽遺傳改良方面的運(yùn)用等，但同時(shí)也存在許多技術(shù)局限性，如細(xì)胞毒性和脫靶效應(yīng)等。為降低脫靶效應(yīng)應(yīng)慎重靶點(diǎn)篩選，適當(dāng)縮小sgRNA長(zhǎng)度，設(shè)計(jì)成對(duì)sgRNA結(jié)合單切口酶或dcas9-fokI融合酶等。

對(duì)于臨床應(yīng)用的安全性，科學(xué)家們也迫切地在大自然中尋找可以控制CRISPR/cas系統(tǒng)的開關(guān)蛋白，繼Bondy-Denomy等[40]、Pawluk等[41]在銅綠假單胞菌分別發(fā)現(xiàn)了關(guān)閉type I-F 和 I-E系統(tǒng)“anti-CRISPR”小分子蛋白（50～150個(gè)氨基酸），這些阻滯蛋白分子量小，可以隨意通過核孔進(jìn)出作用于效應(yīng)蛋白。Rauch等[42]發(fā)現(xiàn)了關(guān)閉TII-A（目前應(yīng)用最廣效應(yīng)蛋白Spcas9）的“anti-CRISPR”蛋白AcrIIA4，并在大腸桿菌和人細(xì)胞上成功抑制了Spcas9/dSpcas9靶向編輯效率。此外，Shin等[43]在體內(nèi)外驗(yàn)證了 AcrIIA4蛋白抑制Spcas9編輯效率，并利用AcrIIA4成功降低了HBB、VEGF基因的脫靶效率。隨著CRISPR系統(tǒng)的深入研究和開發(fā)，期待未來CRISPR系統(tǒng)會(huì)得到更廣闊的發(fā)展和應(yīng)用。

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